Wpływ metaloproteinazy ADAM17 na potencjał przerzutowania komórek lini B16F10 w modelu in vitro.

ADAM17 (TACE-Tumor necrosis factor-α converting enzyme) jako dysintegrynowa metaloproteinza jest zaangażowana w proteolityczne uwalnianie wielu cytokin, czynników wzrostowych, ich receptorów oraz białek adhezji komórkowej, z tego względu wpływa na procesy związane z nowotworzeniem i przerzutowaniem. Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu proteazy ADAM17 na potencjał przerzutowania i wrażliwość na cytokiny komórek lini B16F10 w modelu in vitro. Eksperymenty prowadzono na komórkach stabilnie transfekowanych plazmidami zawierającymi sekwencje shRNA interferujące z mRNA dla ADAM17 oraz komórkach, będących kontrolą procesu wyciszenia. Wyciszenie ekspresji docelowego genu zostało sprawdzone techniką PCR w czasie rzeczywistym i potwierdzone metodą Western Blott.Wykorzystując przejściową transfekcję plazmidami niosącymi shRNA dla ADAM17 lub gen dla ADAM17 modulowano poziom ekspresji ADAM17, a następnie wykonując „test rany” sprawdzano efekt migracyjny. Wykazano, że wyciszenie mRNA dla ADAM17 obniża zdolność komórek do migracji. Natomiast, przywrócenie ekspresji białka w komórkach z obniżonym poziomem ADAM17 zwiększa migrację. Nie zauważono zmiany efektu migracji związanego z nadekspresją w komórkach z wysokim podstawowym poziomem ADAM17. Techniką zymografii sprawdzono poziom produkcji MMP-2 i nie wykazano korelacji z ekspresją ADAM17.Prowadząc dodatkowe analizy związane z wpływem wyciszenia ADAM17, wykazano konstytutywną ekspresję mRNA dla iNOS niezależną od poziomu ADAM17, a ilość uwalnianego NO była poza czułoscią metody Griess’a. Badane komórki nie produkowały także endogennego sTNFα, co sprawdzono testem ELISA. Wykonanie testu MTT, po stymulacji komórek mieszaniną TNFα z IFNγ w stężeniach 10 ng/ml, ujawniło znaczący spadek żywotności komórek. Jednak, nie stwierdzono efektu wiążącego poziom ADAM17 z wrażliwością komórek na cytokiny. Podsumowując uzyskane wyniki, można stwierdzić, że zdolność migracji komórek B16F10 zależy od poziomu białka ADAM17, co może wiązać się ze zdolnością do tworzenia przerzutów. Natomiast, wyjaśnienia wymaga mechanizm molekularny oraz potwierdzenie badań w modelu in vivo.

ADAM17 (TACE-Tumor necrosis factor-α converting enzyme) as a disintegrin and metalloproteinase is involved in the shedding of several membrane-bound cytokines, growth factors, their receptors and adhesion molecules. Thanks to its activity it may contribute to the processes of tumorigenesis and metastasis. The aim of this study was to investigate the influence of ADAM17 on capacity to metastasize and sensitivity to cytokines in murine melanoma cell line (B16F10) in vitro. B16F10 cells with stably silenced ADAM17 by RNA interference (shRNA) or transfected with control plasmid were the experimental model. The effectiveness of transfection was checked, using RT-PCR and confirmed by Western Blott analysis. The transient transfections with plasmids, containing shADAM17 or gene sequence for ADAM17 were conducted to modulate the level of ADAM17 protein. After transfections, the migration of cells was checked with Wound - Healing assay. The results indicate that, ADAM17 depletion inhibited the ability of cells to migrate. Moreover, the effect was reversible after transfection with additional copy of ADAM17 gene. However, no changes in migration were observed after upregulation of ADAM17 in cells with high basal expression. The zymographic analysis showed no correlation between differences in migration and MMP-2 secretion.Furthermore, additional RT-PCR analysis showed constitutive expression of iNOS, but no correlation with ADAM17 silencing and NO production, measured with Griess method. Investigated model cells did not released sTNFα, which could increase metastatic potential. MTT assay indicated significant decrease in cells vitality after stimulation with TNFα and IFNγ in 10 ng/ml concentration each, but no effect connected with ADAM17 silencing was observed. Taken together, the data demonstrated significant influence of ADAM17 on migration of B16F10 cells. The results suggest that ADAM17 can be implicated in the process of metastasis, but further experiments to explain molecular mechanism of action and confirmation by in vivo model are necessary.