Ochratoksyna A (OTA, ang. ochratoxin A) jest jedną z mykotoksyn produkowanych przez grzyby z rodziny Aspergillus i Penicillium. Grzyby te mogą zanieczyszczać żywność przechowywaną w niewłaściwych warunkach m.in.: zboże, kawę, mięso oraz czerwone wino. Najbardziej wrażliwymi na toksyczne działanie OTA są komórki nerek oraz wątroby. Toksyna ta znana jest również ze swoich właściwości kancerogennych oraz jest jednym z czynników wywołujących takie choroby nerek jak Duńska Nefropatia Świńska czy Bałkańska Nefropatia Endemiczna (BEN, ang. Balkan Endemic Nephropathy).Pomimo wielu przeprowadzonych badań wciąż odkrywane są nowe mechanizmy odpowiedzialne za toksyczne działanie OTA. Wiadomo, że toksyna ta nasila apoptozę, zmienia aktywność kinaz, zaburza homeostazę wapniową, uszkadza DNA, powoduje zmiany w regulacji cyklu komórkowego i w oddychaniu mitochondrialnym. Wydaje się, że innym istotnym mechanizmem jest hamowanie odpowiedzi antyoksydacyjnej poprzez wpływ na czynnik transkrypcyjny Nrf2 (ang. nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) oraz zmiana ekspresji wielu genów regulowanych przez Nrf2.Pomimo wykorzystania linii komórkowych do badania działania związków o charakterze nefrotoksycznym ciekawym modelem mogą być hodowle pierwotnych komórek proksymalnych.Celem badań przeprowadzonych w ramach tej pracy magisterskiej była optymalizacja metody izolacji i hodowli pierwotnych komórek proksymalnych RPTC (ang. renal proximal tubular cells). W ramach tego zadania porównano ekspresję genów w komórkach RPTC pozyskanych z nerek myszy Nrf2+/+ i Nrf2-/- oraz zbadano wpływ niedoboru Nrf2 na wywoływane przez OTA zmiany na poziomie mRNA i białka.Podczas optymalizacji metody izolacji i hodowli komórek RPTC zauważono, iż łatwiej izoluje się komórki RPTC z myszy dzikich (Nrf2+/+) niż z myszy pozbawionych genu Nrf2. Analiza ekspresji genów pokazała znaczne różnice w poziomie genów regulowanych przez czynnik Nrf2 – ekspresja oksygenazy hemowej-1 (ang. heme oxygenase 1, HO-1), katalazy czy czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (ang. vascular endothelial growth factor, VEGF) jest niższa w komórkach Nrf2-/- niż w komórkach Nrf2+/+. Wykazano, że OTA w użytym zakresie stężeń (1 μM – 2.5 μM) nie powodowała zwiększenia śmiertelności w komórkach RPTC, ale wpływała na ekspresję badanych genów. Co ciekawe, obserwowano hamujący wpływ OTA na poziom ekspresji Nrf2 jak również zanotowano tendencję do obniżania poziomu ekspresji VEGF, HO-1 i katalazy w komórkach RPTC Nrf2+/+, ale nie w komórkach Nrf2-/-. Nie zaobserwowano jednak zmian w poziomie transformującego czynnika wzrostu 2 (ang. transforming growth factor β2, TGFβ-2), ważnego czynnika profibrotycznego.Przeprowadzone badania pokazują, że izolowane komórki RPTC mogą być dobrym modelem do badania wpływu związków o działaniu nefrotoksycznym, np.: ochratoksyny A. Wykazano, że jednym z toksycznych efektów OTA może być hamujący wpływ na system antyoksydacyjny, poprzez zmianę ekspresji czynnika Nrf2 oraz genów kontrolowanych przez ten czynnik. Metoda izolacji komórek RPTC może być wykorzystywana do badania toksyczności wielu innych związków, stanowiąc alternatywę do badań przeprowadzonych bezpośrednio na zwierzętach.
Ochratoxin A (OTA) is one of the mycotoxins produced by the members of Aspergillus and Penicillium family. OTA may contaminate many food products stored in inappropriate conditions, e.g.: cereals, coffee, meat and red wine. OTA seems to be the most destructive for kidneys and liver cells. It is also well known for its carcinogenic properties and is linked to be the cause of Danish Porcine Nephropathy and Balkan Endemic Nephropathy (BEN).Despite many studies performed on the OTA toxicity, new mechanisms are still discovered. OTA elevates the level of apoptosis, changes kinases activity, perturbs calcium homeostasis, damages DNA structure and disturbs mitochondrial respiration. Nowadays, it seems that diminishment of antioxidant response with concomitant downregulation of Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) may be centrally involved in OTA induced nephrotoxicity.Despite the existence of cell lines used to study the effect of nephrotoxic compounds, the primary proximal cell cultures may be an attractive model.Therefore, the main goal of this study was to optimize the method of isolation and culturing of the renal proximal tubular cells (RPTC). Moreover, the gene expression in RPTC isolated from kidney of Nrf2+/+ and Nrf2-/- mice was compared and the influence of Nrf2 deficiency on OTA toxicity on mRNA and protein level was checked.It was noticed that the isolation of RPTC from Nrf2+/+ mice is easier in comparison to RPTC from Nrf2-/- mice. The significant differences in the expression of genes controlled by Nrf2, like heme oxygenase (HO-1), catalase and vascular endothelial growth factor (VEGF) were observed between Nrf2 knockout cells and Nrf2+/+ cells. OTA in concentrations used (1 μM, 2.5 μM) does not increase mortality rate in RPTC, but it changes gene expression. Interestingly, it was observed that OTA diminishes expression of Nrf2 and its target genes, like HO-1, VEGF and catalase in RPTC Nrf2+/+ cells, but not in RPTC Nrf2-/- cells. There were no changes observed in transforming growth factor β2 (TGFβ2), the main profibrotic factor expression.In summary, we showed that the RPTC may be used as a model to study the effect of nephrotoxic compounds, such as ochratoxin A. One of the mechanisms of OTA toxicity may be an inhibitory effect on the antioxidant system with downregulation of Nrf2 transcription factor activity as well as genes controlled by this factor. RPTC cell isolation method can be used for testing the toxicity of many other compounds as an alternative to experiments performed on animals.
