Phototropin interaction studies using bimolecular fluorescence complementation and yeast two-hybrid system

Plants depend on light. Due to the inability to move they have to react and adapt to fluctuations in the light quantity and quality in real time. This is enabled with specialized photoreceptors which absorb light at a well-defined wavelength. Complex network of signal transmission, with sensory proteins on the top, activates and regulates morphogenetic changes, optimizes photosynthesis and triggers the stress responses. In Arabidopsis thaliana blue light receptors called phototropins mediate phototropism, stomatal opening, leaf positioning and chloroplasts movement. Those processes are caused by photoreceptor interactions with other proteins, which launches stimulus transduction cascade triggered by the blue light quanta absorption. Proteins below phototropins in the signal transmission pathway involved in the control of chloroplast movements are not known. The aim of this study was to investigate the interactions between phototropins, and between phototropins and At5g19150 kinase of unknown function. To study these interactions bimolecular fluorescence complementation technique was used. Phototropin interactions were tested in the yeast two-hybrid system. The fusion constructs implementation, the test vectors creation and the protein interaction tests were described. Formation homo- and heterodimers of phototropins, and interaction of phototropin 2 and At5G19150 protein were shown. The results demonstrate no light-dependence of receptor dimerization process. Additionally, cellular localization of all studied proteins and complexes was identified.

Rośliny zależą od światła i ze względu na brak zdolności przemieszczania się muszą na bieżąco reagować i dostosowywać się do wahań jego ilości oraz jakości. Możliwe jest to dzięki wyspecjalizowanym fotoreceptorom absorbującym światło o ściśle określonej długości. Złożona sieć przekazu sygnału, na której początku znajdują się białka sensorowe, uruchamia i reguluje zmiany morfogenetyczne, umożliwia optymalizację procesu fotosyntezy oraz indukcję odpowiedzi na stres. U Arabidopsis thaliana fototropiny 1 i 2, będące receptorami światła niebieskiego, pośredniczą w fototropizmie, otwieraniu aparatów szparkowych, pozycjonowaniu liści oraz ruchu chloroplastów. Realizacja tych procesów możliwa jest dzięki oddziaływaniu fotoreceptorów z białkami i uruchomieniu kaskady przekazywaniu informacji o absorbowanym bodźcu – kwantach światła niebieskiego. Białka zaangażowane w kontrolę ruchów chloroplastów znajdujące się poniżej fototropin w ścieżce przekazywania sygnału nie są znane. Celem niniejszej pracy było zbadanie wzajemnych oddziaływań między fototropinami, oraz między tymi fotoreceptorami a kinazą At5g19150 o nieznanej funkcji. Do badania tych oddziaływań zastosowano technikę dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Oddziaływania pomiędzy fototropinami sprawdzono dodatkowo metodą dwuhybrydowego systemu drożdżowego. Opisano procedurę wykonania konstruktów fuzyjnych do obu analiz, tworzenia wektorów oraz testów interakcji pomiędzy białkami. Zademonstrowano tworzenie homo- i heterodimerów fototropin oraz oddziaływanie fototropiny 2 z białkiem At5G19150. Wykazano brak zależności procesu dimeryzacji receptorów od światła oraz zidentyfikowano lokalizację komórkową wszystkich badanych białek oraz tworzonych przez nie kompleksów.