Impact of apolipoprotein E polymorphism on macrophage properties in vitro - implications in wound healing with focus on laser microdissection

Apolipoprotein E (ApoE) is a major protein controlling lipid homeostasis with known atheroprotective and anti-inflammatory activities. It exists in humans in three isoforms: ApoE2, ApoE3 and ApoE4. The beneficial immunomodulatory properties of ApoE are weakened in ApoE4 carriers, often leading to development of cardiovascular or neurodegenerative diseases. However, some studies suggest that ApoE4 genotype may provide protection in evolutionarily old, innate processes like wound healing. As macrophages are cells deeply involved in all stages of tissue regeneration, the aim of this study was to investigate the influence of ApoE polymorphism in vitro on their proliferation and migration, properties which may contribute to the wound healing response. Experiments performed on RAW264.7 murine macrophage cell line with or without stable overexpression of human ApoE3 or ApoE4 show that although differences in ApoE genotype has no effect on macrophage proliferation, cell migration is deeply affected. It was found that macrophages overexpressing ApoE4 has basal migratory potential considerably increased. However, differential effects between ApoE3 and ApoE4 were not visible after stimulation of cells lacking either isoform with exogenous human ApoE3 or ApoE4. In our future experiments we plan to explore the effects of ApoE polymorphism in vivo. Because of that, laser microdissection (LMD), a novel sophisticated technique allowing for isolation of distinct structures from tissue sections, was used. Wound healing model was performed on wild type mice, and collected wound tissues were subjected to LMD. The procedure was optimized in context of tissue preparation, dissection process itself, subsequent RNA isolation and analysis of gene expression. Furthermore, different stainings, including the visualization of macrophages, have been checked. Although the first trials were promising, the RNA isolation and staining methods were not fully successful.To conclude, obtained results indicate that ApoE4 genotype is responsible for higher migratory capacity of macrophages. It may suggest that ApoE4 macrophages in vivo are responsible for more pronounced inflammatory phase that may contribute to faster healing of the wound. LMD would be a perfect technique to assess the role of such macrophages in different phases of wound healing response. However, its procedure still requires attentive and accurate optimization before it will be fully suitable for experiments.

Apolipoproteina E (ApoE) jest jednym z najważniejszych białek kontrolujących metabolizm lipidów w organizmie. Szeroko opisane zostały jej właściwości przeciwmiażdżycowe oraz przeciwzapalne. W populacji ludzkiej białko to występuje w postaci jednej z trzech izoform: ApoE2, ApoE3 lub ApoE4. Uważa się, że korzystne immunomodulacyjne działanie ApoE osłabione jest u osobników z izoformą ApoE4, prowadząc często do rozwoju chorób neurodegeneracyjnych czy chorób układu krążenia. Niektóre badania sugerują jednak, że allel ApoE4 może wywierać korzystny wpływ na ewolucyjnie pierwotne, wrodzone procesy takich jak np. gojenie ran. Ponieważ makrofagi wydają się być głównymi komórkowymi mediatorami zaangażowanymi we wszystkie fazy regeneracji uszkodzonej tkanki, celem badań było określenie wpływu polimorfizmu ApoE in vitro na własności proliferacyjne i migracyjne makrofagów, które mogą okazać się ważne dla procesu gojenia ran. Wyniki badań przeprowadzonych na linii makrofagów mysich RAW264.7 kontrolnych bądź ze stabilną nadekspresją ludzkiej ApoE3 albo ApoE4 wskazują, że różnice w genotypie ApoE nie mają wpływu na proliferację makrofagów, wywierają jednak silny wpływ na ich migrację. Dowiedziono, że potencjał migracyjny niestymulowanych makrofagów z nadekspresją ApoE4 jest znacząco zwiększony w stosunku do pozostałych dwóch linii. Nie zaobserwowano jednak różnic we wpływie izoform ApoE na tempo migracji po stymulacji komórek kontrolnych egzogennymi ludzkimi białkami ApoE3 bądź ApoE4.Aby zbadać wpływ polimorfizmu ApoE na status makrofagów in vivo, konieczna jest ich izolacja z preparatów tkankowych z użyciem mikrodysekcji laserowej (LMD). W celu optymalizacji tej metody przeprowadzono eksperyment gojenia ran na myszach typu dzikiego, a zabezpieczone fragmenty zranionej skóry poddano procesowi LMD. Optymalizacja procedury wymagała opracowania metod wstępnego przygotowania tkanki, właściwego etapu mikrodysekcji, izolacji RNA z pobranych wycinków oraz późniejszej analizy ekspresji genów. Ponadto przetestowano procedury barwień fragmentów skóry, w tym fluorescencyjne barwienie na F4/80 w celu wizualizacji makrofagów.Podsumowując, wyniki uzyskane w niniejszej pracy wskazują, że obecność genotypu ApoE4 odpowiada za zwiększone własności migracyjne makrofagów. Możliwe, iż makrofagi z ekspresją ApoE4 są odpowiedzialne in vivo za nasilenie fazy zapalnej procesu gojenia ran, co może się przyczyniać do szybszej regeneracji tkanki. LMD może stanowić idealną technikę umożliwiającą zbadanie roli takich makrofagów w gojeniu ran. Jej procedura jednak wciąż wymaga uważnej i precyzyjnej optymalizacji.