Expression and purification of recombinant human YAF2 factor and studies of its physicochemical properties.

YAF2 was discovered as a factor that promotes myogenesis, which is repressed by YY1. Subsequent researches proved that interaction of those two proteins is highly complex and crucial to proper working of PcG complexes. YAF2 interacts not only with YY1 but it also affects the functioning of other transcription factors like MYC, MYCN and hGABP. Hence its wide spectrum of function YAF2 is essential to control proliferation, differentiation and apoptosis of cells. In spite of conducted researches the structure of YAF2 and its intricate mechanism of regulating cell functioning remain still significantly unknown.The aim of the present work was to obtain biologically active YAF2 protein, that would enable to study its binding to YY1 transcription factor and impact of this interaction on modulation of YY1 capability to bind specific DNA sequences. Prokaryotic expression system was chosen with E.coli cells as a host for exogenous protein production. Expression vectors containing sequence coding YAF2 with tag enabling purification of protein product were made by using techniques of genetic engineering. From attained vectors, pET-21a was selected with YAF2 sequence fused to His-Tag. Various expression conditions were investigated to determine which ones enable obtaining large amount of soluble YAF2. Five strains of E.coli were examined in different temperature with diverse time of incubation and amount of expression inducer used. The protocol for the purification of YAF2 protein was determined basing on Ni NTA affinity, ion exchange and size-exclusion chromatography. Obtained protein was used for measurements of structuralization of its zinc finger conducted using spectrofluorimetry and circular dichroism. Subsequently, the binding of YAF2 to YY1 was examined. The measurements based on spectropolarimetry, size-exclusion chromatography and electrophoretic mobility shift assay did not validate interaction between those two proteins in vitro.

Białko YAF2 zostało odkryte jako czynnik znoszący represję dyferencjacjikomórek mięśniowych, powodowaną przez czynnik transkrypcyjny YY1. Kolejnebadania wykazały, iż oddziaływanie tych białek posiada wiele aspektów, może miećcharakter antagonistyczny lub białka te mogą współdziałać, biorąc udział wfunkcjonowaniu kompleksów PcG. Białko YAF2 oddziałuje nie tylko z YY1, alemodyfikuje działanie także innych czynników transkrypcyjnych, takich jak MYC,MYCN czy hGABP. Ze względu na swoje szerokie spektrum działania jest niezbędnew kontroli procesów proliferacji, dyferencjacji i apoptozy komórek. Pomimoprowadzonych badań, białko YAF2 pozostaje wciąż dosyć słabo poznane, zarówno jeślichodzi o jego strukturę, jak i zawiłe mechanizmy działania oraz regulacjifunkcjonowania komórki.Celem pracy było uzyskanie aktywnego biologicznie białka YAF2, coumożliwiłoby badanie oddziaływania z czynnikiem transkrypcyjnym YY1 oraz wpływutego oddziaływania na modulowanie wiązania białka YY1 do specyficznych dla niegosekwencji DNA. Wykorzystując techniki inżynierii genetycznej, utworzono konstruktyzawierające sekwencje kodujące białko YAF2 wraz z metką, umożliwiającą późniejszeoczyszczenie produktu białkowego, wstawione do wektorów pozwalających naekspresję w komórkach Escherichia coli. Do otrzymania białka wybrano konstruktzbudowany z wektora pET-21a, umożliwiający produkcję cząsteczki YAF2 z dołączonąna C-końcu metką histydynową. Dobrano warunki ekspresji, w których produkowanabyła duża ilość rozpuszczalnego białka. W tym celu sprawdzono 5 szczepów E. coli,poddanych różnym warunkom różniącym się temperaturą, czasem i ilością użytegoczynnika indukującego ekspresję. Następnie opracowano protokół oczyszczania białka,w którym wykorzystano chromatografię powinowactwa na złożu niklowym,chromatografię jonowymienną i sączenie molekularne. Na otrzymanym białkuprzeprowadzono pomiary metodami spektrofluorymetrii i dichroizmu kołowegostrukturyzacji jego palca cynkowego i weryfikację jego oddziaływania z białkiem YY1.Badania wiązania białka YAF2 do czynnika transkrypcyjnego YY1 prowadzonemetodami spektropolarymetrii, sączenia molekularnego i opóźnienia wędrówki DNAw żelu poliakrylamidowym nie wykazały, iż takie oddziaływanie zachodzi in vitro.