Wpływ czynników osteogennych na hodowlę ludzkich komórek MSC w hodowlach 2D i 3D.

Recent progress in cell culture techniques allows culturing various cell types in 3D environment thanks to commercially available and experimental scaffolds. It is now well recognized that traditional 2D cultures are simplified cell culture models and thus they are often replaced by more complex 3D cultures that better reflect physiological environment. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) are currently the most promising source for tissue engineering and regenerative medicine. The potential of MSC to osteogenesis has been well established in scientific literature (Friedenstein & Owen, Ciba Found Symp. 1988). The goal of this work was to identify the potential differences in the osteogenesis of adult human MSC in 2D and 3D culture models. To do that, we have applied InsertTM-PS scaffolds (BIOTEK) and compared such 3D cultures to standard 2D cultures on polystyrene (FALCON). Parallel 2D and 3D cultures of adult human MSC (hMPC 32F; Osyczka et al. Calcif Tissue Int, 2002) were maintained in serum-containing (SC) or serum-free (SF) medium with and without osteogenic supplements: ascorbate (AA-2P), recombinant human bone morphogenetic protein type 2 (rhBMP-2) or dexamethasone (Dex). Cells were analyzed at several culture time points for alkaline phosphatase activity, extracellular matrix deposition, calcification, and gene and protein expressions. Compared to 2D, 3D cultures of adult human MSC displayed significantly higher ALP activity at culture days 10 and 15 in the presence of Dex. They also elevated matrix mineralization and collagen production at 20-day 3D cultures. Untreated cells cultured for 7 days in 3D environment significantly increased protein levels of BMP-2, phospho-Smad 1/5/8 and ERK1/2. The addition of serum to culture media was beneficial to the osteogenic response of hMPC32F compared to serum-free conditions. Our data indicate that the 3D bioinert environment is beneficial to osteogenesis of adult human MSC compared to standard 2D cultures. Moreover, InsertTM-PS scaffolds (BIOTEK) seem to support osteogenesis of adult human MSC with or without osteoinducers. We believe these commercially available scaffolds may serve as a useful 3D cell culture model to study adult human MSC osteogenesis.

Współczesna hodowla komórek w warunkach laboratoryjnych coraz częściej wykorzystuje rusztowania 3D. Liczne eksperymenty potwierdzają, iż przestrzenna hodowla wielu typów komórek bardziej odpowiada ich naturalnemu środowisku i warunkom fizjologicznym w odróżnieniu od tradycyjnej płaskiej hodowli (2D). Wspólne wykorzystanie rusztowań oraz potencjału komórek macierzystych do różnicowania w osteoblasty daje duże możliwości dla medycyny regeneracyjnej oraz inżynierii tkankowej. Celem pracy było zbadanie możliwych różnic w procesie osteogenezy ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) w hodowli 2D i 3D. W pracy użyto dostępnych komercyjnie rusztowań polistyrenowych InsertTM-PS firmy Biotek oraz tradycyjnych płytek hodowlanych firmy Falcon wykonanych z tego samego materiału. W eksperymentach wykorzystano linię ludzkich mezenchymalnych komórek progenitorowych wyprowadzoną ze szpiku kostnego 32-letniej kobiety (hMPC 32F; Osyczka et al. Calcif Tissue Int, 2002). Komórki hodowano w warunkach surowiczych (SCM) lub bezsurowiczych (SFM+) z dodatkiem lub bez czynników stymulujących kościotworzenie in vitro. Były to:dwu-fosforan askorbinianu (AA-2P), rekombinowane ludzkie białko morfogenetyczne kości typu 2 (rhBMP-2) lub deksametazon (Dex). W różnych punktach czasowych w komórkach badano aktywność zasadowej fosfatazy (ALP), depozycję macierzy zewnątrzkomórkowej i stopiń jej mineralizacji oraz ekspresję wybranych białek powiązanych z procesem kościotworzenia w hMSC. W porównaniu do hodowli 2D, w warunkach 3D aktywność (ALP) była istotnie podniesiona w dniu 10 oraz 15 hodowli stymulowanych Dex. Wyraźne różnice na korzyść hodowli 3D zaobserwowano również w dniu 20 hodowli w poziomie mineralizacji macierzy międzykomórkowej i produkcji kolagenu przez hMSC. W 7-dniowych niestymulowanych hodowlach 3D odnotowano istotny wzrost poziomu białek BMP-2, phospho-Smad 1/5/8 oraz ERK1/2 powiązanych z procesami osteogenezy. Dodatek surowicy do pożywki we wszystkich przypadkach miał pozytywny wpływ na odpowiedź hMPC32F w porównaniu do hodowli prowadzonych w warunkach bezsurowiczych.Wyniki przeprowadzonych eksperymentów wskazują na pozytywny wpływ hodowli prowadzonej na rusztowaniach 3D InsertTM-PS scaffolds (BIOTEK). Co więcej, hodowle 3D w znaczący sposób wspomagają przebieg procesu ostogenezy hMSC w obecności jak i przy braku osteoinduktorów.