HSP90 na powierzchni ludzkich makrofagów wyprowadzanych z monocytów.

Makrofagi są komórkami fagocytującymi obecnymi w prawie wszystkich tkankach ludzkiego organizmu. Biorą udział zarówno we wrodzonej jak i w nabytej odpowiedzi immunologicznej. W błonie komórkowej m.in. makrofagów odnajdywane są domeny bogate w cholesterol i sfingolipidy, zwane tratwami lipidowymi. Receptory i cząsteczki zaangażowane w przekaz sygnału grupują się w tych mikrodomenach, dzięki czemu możliwa jest prawidłowa reakcja na bodziec zewnętrzny w postaci np. bakteryjnego LPS. Jedną z molekuł odnajdywanych w tratwach lipidowych, zarówno przed jak i po stymulacji komórek, jest HSP90. Białko to należy do rodziny białek szoku cieplnego, których ekspresja wzrasta pod wpływem czynników stresowych. Wśród klientów HSP90 odnajdywanych jest wiele białek zaangażowanych w ścieżki przekazu sygnału. Wiązanie i hydroliza ATP jest konieczna do prawidłowego funkcjonowania białka in vivo i in vitro. Obecność nietypowej kieszeni wiążącej ATP wyjaśnia wysoką specyficzność naturalnych inhibitorów HSP90, które wiążą się do N-końcowej domeny białka z wysokim powinowactwem – geldanamycyny, radicicolu oraz pozwala na projektowanie ich syntetycznych pochodnych.W poniższej pracy przy pomocy specyficznych przeciwciał wykazano na powierzchni spoczynkowych ludzkich makrofagów wyprowadzanych z monocytów obecność obu izoform HSP90, jak również ekspozycję jego N-końcowej domeny o aktywności ATPazowej. Pokazano, iż inhibitor HSP90 – GE-B nie wnika do wnętrza komórki, blokując tym samym jedynie powierzchniową pulę białka. Przy użyciu tego inhibitora wyznakowano powierzchniową pulę HSP90, potwierdzając tym samym wyniki uzyskane metodą immunofluorescencji. Zmierzono aktywność ATPazową ludzkiego rekombinowanego HSP90 po raz pierwszy wykorzystując w tym celu metodę HTRF. Wykazano zależność produkcji ADP od czasu inkubacji z ATP, stężenia ATP i stężenia białka. Niestety nie udało się zaobserwować wpływu inhibitorów, białka partnerskiego AHA1 i/lub klienta – receptora glukokortykoidowego. Wyniki uzyskane na hMDM wskazują na możliwość wypierania ADP do nadsączu komórkowego przez inhibitory HSP90. Wynik ten może wskazywać, iż powierzchniowe HSP90 występuje w formach związanych z klientem oraz białkami partnerskimi, w konformacji zamkniętej z uwięzionym ATP. Inhibitor działając na taką strukturę HSP90 wymusza dysocjację kompleksów, hydrolizę rezydentnej cząsteczki ATP i uwolnienie ADP.

Macrophages are phagocytic cells resident in almost all human tissues. They orchestrate the innate and the subsequent adaptive immune response. The lipid membrane of many cell types including macrophages contains cholesterol and sphingolipid-enriched domains called lipid rafts. Receptors and signalling molecules group in those microdomains facilitating the proper response to various stimuli, for example bacterial LPS. One of the molecules that is constitutively found in membrane microdomains is HSP90. This chaperone is one of the member of heat shock protein family which expression increases following stress response. Most of its client proteins are involved in signalling pathways. ATP binding and hydrolysis are essential for the function of HSP90 both in vivo and in vitro. The presence of untypical ATP binding pocket in the N-terminal domain of HSP90 explains remarkable specificity of already discovered natural inhibitors – geldanamycin and radicicol and allows to design their synthetic derivatives. In this study we used specific antibodies to show the presence of both isoforms of HSP90 on the surface of human monocyte-derived macrophages and the exposure of N-terminal domain with ATPase activity. We proved that one of the HSP90 inhibitors – biotynylated geldanamycin does not penetrate into the cell thus blocking only the activity of cell surface protein. Using this inhibitor we were able to label cell surface HSP90 confirming our previous immunofluorescence results.For the first time the ATPase activity of human recombinant HSP90 was measured using HTRF assay. We showed that the amount of produced ADP positively correlates with the concentration of ATP, concentration of HSP90, as well as with the time of incubation. Unfortunately, we were not able to observe the effect of inhibitors, co-chaperone AHA1 neither client protein such as glucocorticoid receptor. The results obtained in hMDM indicate that there is a possibility of ousting the ADP which is occupying the ATP binding site by the HSP90-specific inhibitors. This might be the evidence that HSP90 is present on the cell surface in a complex with co-chaperones and client protein, in an ATP trapped state. The inhibitor might affect this structure, leading to a complex dissociation, ATP hydrolysis and release of ADP.