Przygotowanie i charakterystyka konstruktu genetycznego wprowadzającego specyficzną ekspresję białka MCPIP1 w tkance tłuszczowej świń

Otyłość charakteryzująca się nadmiernym gromadzeniem zbędnej tkanki tłuszczowej w organizmie, obecnie uznawana jest także za przewlekłą ogólnoustrojową chorobę zapalną w której tkanka tłuszczowa pełni funkcję narządu endokrynnego produkując liczne cząsteczki bioaktywne (cytokiny, chemokiny, hormony) nazywane ogólnie adipokinami. Prowadzi to do rozwoju zespołu metabolicznego, będącego głównym czynnikiem ryzyka dla cukrzycy typu II, nadciśnienia tętniczego czy chorób sercowonaczyniowych. Badania prowadzone w naszym Zakładzie wskazują na regulację procesu adipogenezy przez białko MCPIP1. Obserwujemy hamowanie różnicowania preadipocytów przy stabilnej ekspresji białka MCPIP1 w mysich embrionalnych fibroblastach 3T3-L1. Ponadto widoczna jest zmniejszona ekspresja C/EBPβ, biorącego udział w regulacji początkowego etapu adipogenezy, a także obniżony poziom PPARγ – głównego czynnika indukującego ten proces. Prowadzi to do zmniejszonej akumulacji lipidów, a w konsekwencji także do zmniejszonej liczby w pełni dojrzałych adipocytów. W związku z tym na potrzeby tej pracy powstał konstrukt genetyczny pozwalający na wprowadzenie specyficznej ekspresji białka MCPIP1 w tkance tłuszczowej u zwierząt. Wykonano klonowanie, w wyniku którego otrzymano transgen zawierający sekwencję kodującą białko MCPIP1 z wprowadzonym między 4 i 5 egzonem pojedynczym intronem. Sekwencja ta została umieszczona pod kontrolą mysiego promotora genu Fabp4, który ulega aktywacji głównie w adipocytach białej tkanki tłuszczowej. Przed wykorzystaniem otrzymanego konstruktu do generacji transgenicznych zwierząt, potwierdzono nadekspresję białka MCPIP1 w testach komórkowych. Następnie wprowadzono go do zarodków świń w procesie mikroiniekcji i tak przygotowane zygoty implantowano do jajowodów samic. Wyniki uzyskane w przyszłości w badaniach przeprowadzonych na wyprowadzonej transgenicznej linii z ekspresją białka MCPIP1 w tkance tłuszczowej posłużą do zrozumienia podstaw rozwoju otyłości i odkrycia nowej terapii leczenia chorób zespołu metabolicznego.

Obesity, a condition characterized by the deposition of inert fat, now is also recognized as a chronic and systemic inflammatory disease, where adipose tissue acts as endocrine organ producing numerous bioactive molecules (cytokines, chemokines, hormones) known as adipokines. This leads to the development of metabolic syndrome, which is the main risk factor for type II diabetes, hypertension, or cardiovascular disease. Studies in our laboratory demonstrate the regulation of adipogenesis by MCPIP1 protein. We report that forced expression of MCPIP1 in mouse embryonic fibroblast 3T3-L1 inhibits C/EBPβ (involved in the regulation of the initial stage of adipogenesis) and PPARγ (universally accepted as the master regulator that is necessary and sufficient to induce adipogenesis) expression at both the protein and transcript level. Inhibition of adipogenesis is manifested by a weaker lipid accumulation and reduced amount of mature adipocytes. Therefore, the purpose of this work was to generate genetic construct for the specific MCPIP1 protein expression in animal adipose tissue. Transgene was prepared by introducing the coding sequence for the protein MCPIP1 (with single intron between 4 and 5 exon) under the murine Fabp4 promoter. FABP4 promoter is activated predominantly in adipocytes of white adipose tissue. Before the use of obtained construct for the generation of transgenic animals, MCPIP1 protein expression was confirmed in cell-based assays. Then, transgene was introduced to the embryos in the microinjection process and so prepared zygotes were implanted into the oviducts of females. The results obtained in the future studies on transgenic lines expressing MCPIP1 in adipose tissue let to understand the basis for the development of obesity and may help to generate new therapies against the metabolic syndrome diseases.