Chlorofilazy Arabidopsis thaliana.Badanie lokalizacji subkomórkowej białek i regulacji ekspresji genów przez światło

Chlorophyllases are important plant enzymes participating in chlorophyll degradation. Recently, researchers questioned not only their participation in chlorophyll decay during senescence, which had previously been treated as certain, but also their presence inchloroplasts.In this work, localization of Arabidopsis thaliana recombinant proteins was examined. The agroinfiltration technique was used on Nicotiana benthamiana to study regulation of chlorophyllase gene promoters by white light. After transformation plants were regenerated in a standard photoperiod for 1 day and then kept in complete darkness or continuous white light for 48 hours. A trial with plants placed in complete darkness right after agroinfiltration has also been performed. The results confirm the regulation of AtCLH2 promoter by light, but no conclusive result for AtCLH1 promoter was obtained. Chloroplast localization of chlorophyllase 2 has been confirmed. Using the floral dip method, transgenic Arabidopsis thaliana lines have been obtained. These lines, carrying genes of fusion proteins chlorophyllase1/2-GFP under control of natural promoters and promoter 35S or GUS gene under control of natural promoters, can serve for further research on chlorophyllase promoter activities and protein localization at various developmental stages.

Chlorofilazy to ważne enzymy roślinne uczestniczące w degradacji chlorofilu. Na podstawie wyników badań przeprowadzonych w kilku ostatnich latach poddano jednak w wątpliwość ich udział w rozkładzie chlorofilu podczas starzenia, który był dotychczas uznawany za pewnik, a także zakwestionowano ich lokalizację w chloroplastach.W niniejszej pracy zbadano faktyczną lokalizację rekombinowanych białek obu chlorofilaz z Arabidopsis thaliana. Zbadano też regulację aktywności ich promotorów przez światło białe wykorzystując technikę agroinfiltracji Nicotiana benthamiana z użyciem białka reporterowego GUS. Rośliny po transformacji były hodowane w standardowym fotoperiodzie przez 1 dobę, a następnie umieszczane w całkowitej ciemności lub w ciągłym świetle białym na następne 48 godzin. Wykonano również próbę z roślinami umieszczonymi w ciemności natychmiast po transformacji. Potwierdzono silną aktywację promotora AtCLH2 przez światło, jednak nie udało się uzyskać jednoznacznych wyników dla promotora AtCLH1.Potwierdzono również chloroplastową lokalizację chlorofilazy 2. Ponadto, za pomocą metody floral dip uzyskano transgeniczne linie Arabidopsis thaliana zawierające geny kodujące fuzyjne białka chlorofilaza1/2-GFP pod kontrolą promotorów naturalnych oraz silnego promotora 35S, a także gen reporterowy GUS pod kontrolą naturalnych promotorów. Linie te będą wykorzystane do dalszych badań nad aktywnością promotorów chlorofilaz oraz subkomórkowej lokalizacji tych enzymów w różnych stadiach rozwoju roślin.