Effect of cyclic nucleotides metabolism disorders on mouse spermatogenesis

Cykliczny 3’5’-adenozynomonofosforan (cAMP) pełni istotną rolę w wielu procesach biologicznych jako drugorzędowy przekaźnik uczestniczący w wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Szlak sygnalizacyjny związany z kinazą białkową zależną od cAMP jest jednym z podstawowych regulatorów procesów komórkowych, w tym procesu steroidogenezy stymulowanej hormonami. W kontroli poziomu cAMP biorą udział enzymy z grupy fosfodiesteraz. Fosfodiesteraza 8B (PDE8B) jest enzymem katalizującym reakcje hydrolizy cyklicznego wiązania fosforanowego w cAMP prowadząc do powstania nieaktywnego produktu adenozyno-5’-monofosforanu (5'AMP). Celem niniejszej pracy było zbadanie roli PDE8B w regulacji ekspresji i lokalizacji dwóch białek kluczowych dla przebiegu spermatogenezy, receptora androgenowego (AR) i N-kadheryny w jądrach myszy. Materiałem badawczym były tkanki jąder myszy z knockoutem genu Pde8b (PDE8BKO) oraz myszy laboratoryjnej szczepu C57BL/6 typu dzikiego. W celu oceny morfologicznej skrawki jąder poddano barwieniu hematoksyliną i eozyną. Do zbadania lokalizacji białek AR i N-kadheryny w jądrach wykorzystano metodę immunohistochemiczną, natomiast względną ekspresję tych białek określono z zastosowaniem analizy Western blot. W jądrach myszy PDE8BKO stwierdzono uszkodzenie struktury i rozluźnienie nabłonka plemnikotwórczego. Analiza immunohistochemiczna białka AR u myszy PDE8BKO wykazała delokalizację receptora w komórkach Sertoliego oraz spadek intensywności sygnału w komórkach Sertoliego i mioidalnych w porównaniu do zwierząt kontrolnych. U myszy PDE8BKO zaobserwowano także zmianę lokalizacji N-kadheryny. Rozproszone zabarwienie rozciągało się przez dużą część nabłonka plemnikotwórczego a intensywność sygnału była obniżona w regionie bariery krew-jądro. Wykonana analiza Western blot potwierdziła obecność obu białek w jądrach i specyficzność działania wykorzystanych przeciwciał. Analiza densytometryczna pozwoliła stwierdzić istotny statystycznie spadek poziomu białek AR i N-kadheryny w jądrach myszy PDE8BKO (P<0,05) w porównaniu do poziomu białek w jądrach myszy grupy kontrolnej. Podsumowując, obserwowane u myszy PDE8BKO zaburzenia w budowie kanalików nasiennych i obniżenie ekspresji białek biorących udział w procesie spermatogenezy wskazują, że obecność białka PDE8B jest niezbędna dla odpowiedniego funkcjonowania jąder i prawidłowego przebiegu spermatogenezy.

3’-5’-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) plays an important role in many biological processes acting as secondary messenger in intercellular signal transduction pathways. The cAMP-dependent protein kinase (PKA) signaling pathway is an essential regulator of many different physiological processes, including hormone-stimulated steroidogenesis. Proper cAMP level is maintained by the action of phosphodiesterases. Phosphodiesterase 8B (PDE8B) is the enzyme which catalyzes hydrolysis of the cyclic phosphate bond in cAMP to generate inactive metabolite adenosine 5-monophosphate (5’AMP). The aim of the present study was to examine the role of PDE8B in the regulation of the proteins crucial for spermatogenesis: androgen receptor (AR) and N-cadherin in mouse testis. The study was performed on testicular tissues isolated from Pde8b knock-out mice (PDE8BKO) and wild-type C57BL/6 mice. Morphological analysis was carried out by hematoxylin-eosin staining. Localization and expression of AR and N-cadherin were analyzed using immunohistochemistry and Western blot, respectively. In the testis of PDE8BKO mice morphological alterations of the seminiferous epithelium were observed. Immunohistochemical analysis of AR protein showed delocalization of the receptor in Sertoli cells and decreased staining intensity in Sertoli cells and peritubular myoid cells of PDE8BKO when compared to the controls. Moreover, changes in N-cadherin distribution were evident in PDE8BKO. Diffuse, cytoplasmic staining was detected in the seminiferous epithelium and staining intensity in the blood-testis barrier region was significantly decreased. Western blot analysis confirmed the presence of AR and N-cadherin proteins in male gonads as well as antibodies specificity. Moreover, densitometric analysis has shown statistically significant decrease in the level of AR and N-cadherin proteins in the testis of PDE8BKO mice (P <0.05) compared to wild-type mice. In summary, disturbances in the structure of the seminiferous tubules, altered localization and decreased expression of proteins involved in the processof spermatogenesis observed in PDE8BKO indicate that PDE8B protein is essential for the maintenance of structure and function of the testis and normal spermatogenesis process.