Zaburzenia ekspresji ceruloplazminy w organach myszy mutantów Atp7a mo-ms

Copper and iron belong to a group of the most common trace element in the human body. Because of its redox properities, serve as cofactors of many enzymatic reactions, essential for normal cellular function. However, the reduced forms of these elements Cu+ and Fe2+ can participate in the Fenton reaction and may contribute to the formation of dangerous for cells, reactive free radicals, which are able to destroid proteins, lipids and nucleid acids. Therefore it is necessary to maintain a relatively constant level of both copper and iron ions – in mammals this function fulfils ceruloplasmin – a glycoprotein belonging to a family of multicopper oxidases, which hale a key role in the control of iron metabolism. The process of alternative splicing is responsible for the production of two forms of this protein: soluble ceruloplasmin – produced mainly in the liver and secreted into the blood and GPI-Cp – localized in the membrane of some cells. The aim of this study was to determine the changes in the Cp gene expression at the mRNA level of two splice forms of ceruloplasmin in the organs of mice with the mutation in the gene Atp7a - representing an animal model of Menkes disease – including the impact of applied therapy with CuCl2 injections. Additionally, performed immunofluorescence analysis enabled the identification and localization of the protein within the examined tissues. Obtained findings indicate tissue-specific expression pattern of both splice forms and the key role of interaction between Cu and Fe level in this process. The liver of young Atp7a mutant mice, unlike brain and kidneys shows a significant decrease in transcript level of secreted Cp, which could be one of the reasons of the absence of this protein in blood plasma. Applied CuCl2 injections result in significant increase of the transcripts of secreted form – but only in the liver (not brain and kidneys) of the Atp7a mutant mice. There was no influence of CuCl2 injection in the organ of wild-type mouse. In both the liver and kidneys of the Atp7a mutant mice rose the level of GPI-Cp transcript and high level of accumulated Fe ions and inflammation are probably responsible for that. It was not observed in the brain of Atp7a mutant mice. The immunofluorescence analysis showed a strong signal of membrane-bound localization of Cp on the Browicz-Kupffer cells in the liver and macrophages in the area of the cortex Atp7a mutant mice.Injections with CuCl2 did not change the level of transcript for GPI-Cp in all tested organs of young wild-type genotype mice, but in the case of young Atp7a mutant mice led to decrease in the level of this form in the liver and kidneys.

Miedź i żelazo należą do grupy mikroelementów najbardziej rozpowszechnionych w ciele człowieka. Ze względu na wykazywane właściwości oksydo-redukcyjne, spełniają rolę kofaktora wielu reakcji enzymatycznych niezbędnych dla prawidłowego funkcjonowania komórek. Jednak zredukowane formy tych pierwiastków - jony Cu+ jak i Fe2+ - uczestnicząc w tzw. reakcji Fentona, mogą przyczyniać się do powstawania niebezpiecznych dla komórek, wysoce reaktywnych wolnych rodników, które zdolne są do niszczenia zarówno białek, lipidów jak i kwasów nukleinowych. Dlatego konieczne jest utrzymywanie względnie stałego poziomu zarówno miedzi jaki i żelaza w komórkach organizmu – funkcję tą u ssaków spełnia ceruloplazmina – glikoproteina należąca do grupy multimiedziowych oksydaz, pełniących kluczową rolę w kontroli metabolizmu żelaza. Proces alternatywnego splicingu odpowiedzialny jest za produkcję dwóch form tego białka: ceruloplazminy sekrecyjnej -produkowanej głównie w wątrobie i wydzielanej do krwi oraz ceruloplazminy GPI – zakotwiczonej w błonie komórkowej. Celem pracy było określenie zmian ekspresji genu Cp na poziomie mRNA dla dwóch form splicingowych ceruloplazminy w organach myszy z mutacją genu Atp7a stanowiących zwierzęcy model choroby Menkesa z uwzględnieniem wpływu zastosowanej terapii CuCl2. Dodatkowo, przeprowadzona analiza immunofluorescencyjna umożliwiła określenie lokalizacji form badanego białka w obrębie badanych tkanek.Otrzymane wnioski wskazują na tkankowo-specyficzny wzór ekspresji obu badanych form splicingowych ceruloplazminy oraz kluczową rolę współdziałania jonów Cu i Fe w tym procesie. Wątroba młodych myszy mutantów Atp7amo-ms w odróżnieniu od nerek i mózgu wykazuje znaczny spadek poziomu transkryptu sekrecyjnej formy Cp, co staje się jedną z przyczyn nieobecności tego białka w osoczu krwi. Stosowane iniekcje CuCl2 skutkują znacznym podniesieniem ilości transkryptu dla tej formy w wątrobie myszy mutantów, jednak podobnej zależności nie obserwuje się w nerkach i mózgu badanych zwierząt, ani w grupie osobników o genotypie dzikim traktowanych CuCl2. Zarówno w wątrobie jak i nerce młodych myszy mutantów Atp7amo-ms dochodzi do podniesienia poziomu transkryptu dla błonowej formy ceruloplazminy, za co prawdopodobnie odpowiedzialny jest wysoki poziom Fe gromadzony w tych tkankach oraz stan zapalny rozwijający się w nerkach tych myszy. Zależności tej nie obserwuje się w mózgu badanych myszy mutantów.Analiza immunoflorescencyjna wykazała silny sygnał błonowej lokalizacji ceruloplazminy na komórkach Browicza-Kupffera wątroby oraz makrofagach w rejonie kory nerki tych myszy. Iniekcje CuCl2 nie wpłynęły na zmianę poziomu transkryptu błonowej formy ceruloplazminy we wszystkich badanych organach myszy o genotypie dzikim, jednak w przypadku młodych myszy mutantów Atp7amo-ms doprowadziły do spadku poziomu tej formy w wątrobie i nerce badanych zwierząt. W nerkach dorosłych myszy mutantów Atp7amo-ms zaobserwowano istotny wzrost poziomu transkryptu zarówno dla sekrecyjnej jak i błonowej formy ceruloplazminy, przy czym zależności tej nie obserwowano w pozostałych analizowanych organach.