The use of Raman spectroscopy to biochemical imaging of brain tissue

W wykonanej pracy magisterskiej przeprowadzono pomiary techniką spektroskopii ramanowskiej oraz spektroskopii w podczerwieni tkanek mózgu myszy C57BL/6J. Pomiary ramanowskie wykonywano z zastosowaniem lini lasera 532 nm. Dla otrzymanych wyników przeprowadzono analizę integracyjną po pasmach markerowych oraz analizę skupień metodą k-średnich, aby otrzymać mapy dystrybucji poszczególnych składników tkanek mózgu. Pomiary przeprowadzono dla dwóch obszarów istoty białej i szarej, które są zróżnicowane pod względem dystrybucji lipidów i białek. Analizę oscylacyjną przeprowadzono w zakresie spektralnym 600 – 1800 cm-1, 1250 – 1350 cm-1 oraz 2800 – 3200 cm-1 w celu zbadania różnic intensywności poszczególnych pasm charakterystycznych dla związków obecnych w tkankach mózgu. Spektroskopię Ramana i FTIR zastosowano do rozróżnienia struktur istoty szarej i białej mózgu. Dokonano analizy oscylacyjnej tkanek mózgu z obszarów występowania istoty szarej i białej. Dla uśrednionych widm ramanowskich odpowiadającym istocie szarej i istocie białej porównano intensywność pików 1440/1660 oraz 1300/1250 cm-1 pozwalające na ich zróżnicowanie. Mapy dystrybucji poszczególnych komponentów próbki powstały w wyniku integracji pasm w zakresie 2800 – 3050 cm-1 (obrazują cały obszar badanej tkanki ponieważ odpowiadają drganiom rozciągającym wiązania C-H występującego we wszystkich związkach organicznych) 2850 cm-1 (zakres charakterystyczny dla ugrupowań lipidowych, jednonienasyconych kwasów tłuszczowych oraz szczególnie dla estrów cholesterolu), oraz 745 cm-1 (hemoglobina). Analiza skupień dystrybucji substancji metodą k-średnich dla obszarów istoty białej i istoty szarej pozwoliła na zobrazowanie ugrupowań lipidowych i białkowych, a także na przedstawienie skupisk cholesterolu obecnych w istocie białej. Zastosowanie techniki FTIR pozwoliło na uzyskanie pełnego widma oscylacyjnego tkanki mózgu. Zmierzono większy obszar tkanki dzięki temu otrzymany wynik był bardziej reprezentatywny i uniezależniony od wyboru obrazowanego obszaru. Dla otrzymanych wyników przedstawiono mapy spektralne w zakresie 1620-1680 cm-1 oraz 2800 - 3025 cm-1 obrazujące odpowiednio dystrybucję białek i lipidów. W celu przeprowadzenia dokładniejszej analizy porównawczej uśrednionych widm FT-IR przedstawiono widma drugich pochodnych. Technika ta pozwala na zwiększenie rozdzielczości widm oraz określenie liczby i położenia pasm składowych.Technika spektroskopii Ramana oraz spektroskopii w podczerwieni pozwoliły na biochemiczne zobrazowanie tkanek mózgu. Połączenie dwóch oscylacyjnych technik umożliwiło biochemiczne zobrazowanie różnic pomiędzy istotą szarą i białą mózgu jak również zobrazowanie określonej grupy związków takich jak lipidy (zwłaszcza kryształy cholesterolu) i białka.

The presented work demonstrate the capability of Raman spectroscopy supported with the FTIR to study the biochemical composition of the brain tissue isolated from a C57BL/6J mice model. Raman maps were obtained with the use of 532 nm excitation wavelength. The results were analyzed by integration over a specific marker bands and with the use of k-means cluster analysis (KMC) to visualize the distribution of the individual components of the brain tissue. The measurements were carried out for two brain areas: white and gray matter which are consisted of the various contents of proteins and lipids. The analysis was performed in spectral range of 600 – 1800 cm-1, 1250 – 1350 cm-1 and 2800 – 3200 cm-1 in order to carry out the detailed differentiation between the wavenumber and intensity of a specific bands characteristic for the compounds presented in the brain tissue. Raman and FTIR spectroscopy were used to distinguish and characterize the gray and white matter of the brain. In order to study the lipid profile of brain structures the comparison of the intensity ratio of 1440/1660 and 1300/1250 cm-1 bands was carried out. To visualize the main tissue compounds different Raman maps were obtained by integration of the bands at around of 2800 – 3050 cm-1 (CH stretching region allows the visualization of the distribution of the sum of all organic matter), 2850 cm-1 (lipids, monounsaturated fatty acids and especially esters of cholesterol) and 745 cm-1 (hemoglobin). K-means cluster analysis for the gray and white matter allowed to image the classes of lipids and proteins as well as the additional cholesterol class for the white matter.Application of FTIR spectroscopy, which is a complementary technique to Raman spectroscopy, allowed to obtain a full vibrational spectrum of the brain tissue. This method provided a possibility to measure a greater area of brain tissue but with lower spatial resolution. FTIR maps were obtained by the integration at 1620-1680 cm-1 (proteins) and 2800 - 3025 cm-1 (lipids). In order to perform more detailed analysis the second derivative was calculated for average FTIR spectra of gray and white matter. Raman spectroscopy was found to be a useful method to provide the biochemical fingerprint for different brain structures. The combination of the both vibrational techniques enabled the biochemical differentiation between the brain gray and white matter as well as imaging of the specific group of compounds such as lipids (particularly cholesterol crystals) and proteins.