Multimodal ex vivo imaging of vascular wall with Raman spectroscopy and AFM methods to study cardiovascular pathologies

Atherosclerosis is a chronic disease recognized nowadays as the major cause of death worldwide. Its silent progress makes diagnosis a real challenge, as symptoms appears at a very advanced step of the disease (e.g. stenosis causing strokes and heart attacks). Current diagnosis of the disease step usually requires heavy methods (e.g. angiography) and now less invasive as well as expensive techniques are being developed.Sensitive, reproducible and less expensive, optical spectroscopies show interesting features for this purposes. Particularly, we propose here to apply spatially resolved Raman spectroscopy in order to open new ways toward early atherosclerosis diagnosis. The marker proposed here is the tetrahydrobiopterin (BH4) deficiency, specific to endothelial dysfunction, indirectly probed by tyrosine and phenylalanine contents disturbance.The method is firstly applied to mice, comparing control (C57) with genetically ApoE deficient mice, animal model of human atherosclerosis. Tunica media and intima of aorta and pulmonary arteries (PA) is mapped using Raman imaging and chemical information is obtained by extraction of particular spectra by the use of chemometrics tools (i.e. K-means cluster analysis).The same procedure is then applied to human vascular tissues, obtained from bypass surgery patients suffering from cardiovascular diseases. A morphological study of mouse and human vascular wall differences is also provided by coupling optical and atomic force microscopy (AFM).This study offers comprehension and description of tunica intima and tunica media behaviours upon pathology and age. Tyrosine-to-phenylalanine ratio is showed as a potential biomarker of atherosclerosis, as well as amounts of this amino acids taken separately. Outcomes of this study confirm previous work on Raman spectroscopy used for diagnosis of cardiovascular diseases.

Miażdżyca jest chorobą przewlekłą, uważaną obecnie za główną przyczynę śmierci na świecie. Jej powolna, ciężka do wykrycia progresja stanowi prawdziwe wyzwanie, gdyż jej wyraźne objawy pojawiają się dopiero w zaawansowanym stadium (na przykład zwężenie ściany tętnic, które powodujące wylew krwi do mózgu bądź zawał serca). Obecnie stwierdzenie progresji choroby wymaga użycia metod inwazyjnych, na przykład angiografii, dlatego wskazanym jest rozwinięcie mniej inwazyjnych oraz mniej kosztownych metod niezbędnych do zdiagnozowania miażdżycy.W porównaniu z dotychczasowymi metodami, metody spektroskopii optycznej jawią się jako interesujące alternatywy, ze względu na wysoką czułość, powtarzalność oraz zauważalnie niższe koszty eksploatacji. W poniższej pracy zastosowano mikrospektroskopię ramanowską jako próbę znalezienia nowego sposobu do wcześniejszej diagnozy miażdżycy. Jako marker zaproponowano niedobór tetrahydrobiopteryny (BH4), właściwej dla dysfunkcji śródbłonka, prowadzącej bezpośrednio do zaburzenia w zawartości fenyloalaniny i tyrozyny. Ta metoda została po raz pierwszy zastosowana na mysich modelach, zdrowych (C57) oraz genetyczne pozbawionych ApoE – zwierzęcego odpowiednika ludzkiej miażdżycy. Tunica media oraz intima, jedne z warstw aorty, oraz tętnica płucna (PA) zostały poddane mapowaniu metodą mikrospektroskopii ramanowskiej. Z otrzymanych map za pomocą metod chemometrycznych (np. analizy skupień) wyciągnięto chemiczną informację obserwowanych struktur. Ta sama metodyka została następnie wykorzystana do zbadania ludzkich tkanek naczyniowych, uzyskanych w trakcie zabiegu wszczepiania bajpasów od chorych cierpiących na choroby układu krążenia. Przebadano także zmiany w morfologii ścian naczyń u myszy i ludzi dzięki połączeniu mikrospektroskopii ramanowskiej z mikroskopią sił atomowych (AFM). W pracy podjęto próbę wyjaśnienia zmian w warstwach śródbłonka, tunica media oraz tunica intima, pojawiających się wraz z rozwojem choroby. Stosunek tyrozyny do fenyloalaniny, jak również ilość tych aminokwasów oddzielnie, zostały wykorzystane jako potencjalne biomarkery postępu miażdżycy. Wyniki poniższej pracy potwierdzają zatem możliwość zastosowania spektroskopii ramanowskiej w diagnozie chorób układu krążenia.