Optymalizacja otrzymywania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz ich różnicowania do kardiomiocytow

The discovery that defined transcription factors can reprogram somatic cells towards pluripotency opened new possibilities for investigating developmental biology, disease modelling and regenerative medicine. As induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the potential to differentiate into any cell type of the adult organism they are an invaluable source of hardly available human cells, including cardiomyocytes. To fully exploit this potential, efficient protocols for derivation of such cells need to be developed. For that purpose, in the present study, human fibroblasts were reprogrammed to iPSCs (hiPSCs) with different culture conditions and transgene delivering vectors. Both lentiviral and Sendai virus-based vectors enabled formation of iPSC-like colonies in Essential 8 medium which could be further expanded and characterized. Out of four hiPSC lines, 3 demonstrated pluripotency markers on mRNA and protein level and were further differentiated to cardiomyocytes with three methods in order to find the most efficient approach. Interestingly, utilization of three components medium (CDM3), the most straightforward described method resulted in massive cell death and no cardiomyocyte formation. On the other hand, successful derivation of these cells was achieved with B27 minus insulin (B27-ins) supplement, where confluency and timing of Wnt signalling pathway inhibition appeared to be crucial. Additionally, contracting cells were obtained with commercially available PSCs Cardiomyocyte Differentiation kit, with starting confluency having a similar important influence on efficiency of differentiation. Derived cells were positive for signal regulatory protein alpha (SIRPa), a cardiac-specific surface marker and expressed regulatory and structural proteins characteristic for cardiac lineage. Results obtained in this study will facilitate developing the most efficient conditions for differentiation of hiPSCs to cardiomyocytes.

Odkrycie metody reprogramowania komórek somatycznych za pomocą zdefiniowanych czynników transkrypcyjnych wprowadziło nowe możliwości w badaniach biologii rozwoju, modelowaniu chorób czy też medycynie regeneracyjnej. Powstające w tym procesie tzw. indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ang. induced pluripotent stem cells, iPSCs) posiadają bowiem zdolność do różnicowania we wszystkie typy komórek organizmu, dzięki czemu mogą stać się cennym źródłem trudno dostępnych ludzkich komórek, takich jak kardiomiocyty. Niemniej, by w pełni wykorzystać ten potencjał muszą zostać opracowane wydajne metody otrzymywania takich komórek z ludzkich iPSCs. W tym celu, w niniejszej pracy wykorzystano różne metody hodowli oraz różne wektory wirusowe w celu reprogramowania ludzkich fibroblastów. Zarówno wektory lentiwirusowe jak i oparte na wirusie Sendai pozwoliły na otrzymanie w pożywce Essential 8 kolonii komórek iPSC, które następnie pobrano do dalszej hodowli i oznaczenia ekspresji markerów charakterystycznych dla macierzystych komórek zarodkowych. Do dalszych doświadczeń wybrano trzy linie, które wykazały obecność takich markerów. W celu określenia najbardziej wydajnego sposobu ich różnicowania do kardiomiocytów, zastosowano trzy opisane w literaturze metody. Wykorzystanie trójskładnikowej pożywki CDM3 nie pozwoliło na otrzymanie kardiomiocytów ze względu na śmierć komórek w początkowych dniach różnicowania. Udało się to natomiast w przypadku metody wykorzystującej suplement B27 bez insuliny oraz przy pomocy zestawu PSC Cardiomyocyte Differentation Kit. W obu podejściach decydujący wpływ na wydajność otrzymywania kurczących się komórek wydaje się mieć konfluencja iPSCs przy rozpoczęciu różnicowania. Otrzymane kardiomiocyty wykazywały obecność sercowo-specyficznego białka powierzchniowego SIRPa (ang. signal regulatory protein alpha) oraz ekspresję białek regulatorowych i strukturalnych charakterystycznych dla kardiomiocytów. Uzyskane w niniejszej pracy wyniki przyczynią się do opracowania w przyszłości najbardziej wydajnej metody uzyskiwania komórek sercowych z ludzkich iPSCs.