Optimization of peptides fractionation in SHOTGUN experiment, and functional analysis of rat brain cortex proteins

Tandemowa spektrometria mas jest nowoczesnym i skomplikowanym narzędziem umożliwiającym dokładną analizę proteomu. Z pośród tysięcy białek możemy wyodrębnić i analizować mniejsze grupy, które nas interesują. W celu zwiększenia liczby zidentyfikowanych cząsteczek, a zatem uzyskania pełniejszej informacji na temat badanej próbki, białka lub powstałe w wyniku trawienia peptydy poddaje się frakcjonowaniu. Proces ten pozytywnie wpływa na ilość zsekwencjonowanych peptydów, a co za tym idzie liczbę zidentyfikowanych białek. Etap rozfrakcjonowania czy też wzbogacenia białek/peptydów jest niezbędny do prawidłowej analizy proteomu, dotyczy to zarówno analizy pojedynczych komórek jak i całej tkanki. Obecnie najpowszechniej stosowane są dwie metody frakcjonowania: chromatografia jonowymienna i izoogniskowanie. W niniejszej pracy skupiono się na drugim ze sposobów, a konkretnie na dwóch jego wariantach, żelowym i bezżelowym rozdziale peptydów. W obu podejściach wykorzystywane są paski z unieruchomionym gradientem pH, jednak w jednym z nich rozdział peptydów przebiega w roztworze, natomiast w drugim pozostają one w żelu. Celem pracy było porównanie obydwu metod i ustalenie, który sposób rozdziału peptydów jest bardziej wydajny i kompatybilny z dalszymi etapami analizy proteomicznej. W szczególności porównano metody pod względem ich przydatności w analizach silnie hydrofobowych białek błonowych, takich jak receptory, które są częstym obiektem rozważań prac neurobiologów. W dalszej części pracy listę zidentyfikowanych białek poddano analizie bioinformatycznej pod względem ich przynależności do grup funkcjonalnych. W wyniku przeprowadzonych eksperymentów proteomicznych uzyskano informacje dotyczące proteomu mózgu szczura. W ostatniej części pracy przeanalizowano zidentyfikowane białka pod kątem obecności białek markerowych dla poszczególnych typów komórek układu nerwowego. Semiilościowe porównanie zawartości białek markerowych w próbce mogłoby umożliwić określenie stosunku ilości danego typu komórek w badanej tkance.

Mass spectrometry-based, so-called shotgun, approach enables an analysis of changes in expression of entire set of proteins of given organism or tissue. In order to increase the number of identified proteins, it is important to decrease the complexity of the sample prior to LC-MS/MS measurement. Isoelectrofocusing (IEF) is one of the most popular technique, which utilizes the differences in peptides isoelectric points (pI) for separation. The peptides migrate within pH gradient toward electrode of opposite charge as long as they reach pH equal to their pI value where they lose their charge. It allows to divide whole studied proteome into a several fractions which can be exhaustively analyzed by mass spectrometry.In our research, we compared the separation efficiency of two IEF methods. We used the lysate of rat cortex as a testing material. The first method is based on classical technique applying immobilized pH gradient (IPG) strips, and the second used method is called as “in solution” or OFFGEL. Collected fractions were dried and purified on C18 stage tips. Peptides from each fraction were analyzed by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometer – microTOF-QII (Bruker).The aim of this work was to describe the differences between both methods and find advantages of any of them. We compared the number of all peptides identified after separation and also the number of unique peptides in each fraction, what could be the indicator of resolving power of these two methods. Our results show that the IPG method might be a bit less efficient, and we supposed that “in solution” fractionation method could be improved. As we showed in case of three next trials the differences between two methods became less visible. The additional goal of the present work was to characterize the rat cortex proteins which were found in our research, and to find markers for different type cells like neurons or astrocytes.