Ocena aktywności kaspazy-3 w komórkach neuroblastomy eksponowanych na jony manganu i glinu w modelu in vitro neurocytoprotekcji wybranych polifenoli

In the 21st century, in times of growing industrialization, the incidence of neurodegenerative diseases increases – just as human exposure to toxic chemicals does. The clinically proven influence of environmental factors on development of neurodegenerative process presents new challenges to today’s diagnostics. Its objective is now not only to search for methods of the earliest detection of neurodegenerative diseases but also to contribute to development of their prevention.The aim of this study was to assess the activity of caspase-3 as a biomarker of apoptosis in neuroblastoma cells exposed to manganese and aluminum ions. Another goal was to examine the neuroprotective effect of resveratrol and quercetin on those cells. In vitro model was used in the study.Cells used in this study belonged to the human derived cell line called SH-SY5Y. Cells had been treated with growing concentrations of polyphenols and then were being incubated for 72 hours with aluminum (3 mmol/l) and manganese ions (1 mmol/l). Cytotoxicity of those metals and possible protective properties of polyphenols were both assessed by LDH assay, MTT reduction test and caspase-3 activity assay.LDH and MTT assays revealed a significant influence of both metals on the loss of neuroblastoma cells viability. While in cells incubated with aluminum polyphenols were increasing metal’s toxicity in all of their concentrations, in cells exposed to manganese ions such effect was only observed for concentrations higher than 20 µmol/l. In concentrations of 5 and 10 µmol/l both resveratrol and quercetin had a tendency to lessen manganese neurotoxicity. Caspase-3 activity assay showed no statistically significant changes for cells exposed to aluminum. A considerable increase of caspase-3 activity was observed in cells incubated with manganese. Polyphenols added to those cells proved to have a neuroprotective effect in all of their four concentrations.LDH assay and MTT reduction test confirmed the toxic effects of aluminum and manganese ions on neural cells. In addition, caspase-3 activity assay provided data to distinguish between two different ways those metals induce cell death. While for manganese it is apoptosis, for aluminum the dominant cell death pathway is necrosis. Results obtained for manganese ions also suggest that polyphenols used in this study have a protective effect only in concentrations up to 10 µmol/l. In higher concentrations they seem to intensify damaging effects leading to cell death.

W XXI wieku, w dobie postępującej industrializacji, zapadalność na choroby neurodegeneracyjne wzrasta – podobnie jak wzrasta ekspozycja człowieka na toksyczne substancje chemiczne. Udowodniony wpływ czynników środowiskowych na rozwój procesów neurodegeneracyjnych stawia przed dzisiejszą diagnostyką nowe wyzwania. Do jej zadań należy już nie tylko poszukiwanie metod jak najwcześniejszego wykrywania chorób układu nerwowego, ale także wkład w rozwój ich profilaktyki.Celem pracy była ocena aktywności kaspazy-3 jako markera apoptozy w komórkach neuroblastomy eksponowanych na jony manganu i glinu, a także zbadanie neuroprotekcyjnego działania kwercetyny i rezweratrolu w tych komórkach. Badania prowadzono w modelu in vitro.W badaniach wykorzystano linię komórkową ludzkiej neuroblastomy (SH-SY5Y). Na komórki działano wzrastającymi stężeniami polifenoli, a następnie inkubowano je przez 72 godziny z jonami glinu (3 mmol/l) i manganu (1 mmol/l). Cytotoksyczność metali i ewentualny efekt protekcyjny polifenoli oceniano, wykonując testy LDH i MTT oraz oznaczając aktywność kaspazy-3.Testy LDH i MTT wykazały istotny wpływ obu metali na spadek żywotności komórek neuroblastomy. W komórkach inkubowanych z jonami glinu polifenole we wszystkich stężeniach zwiększały efekt toksyczny. W przypadku jonów manganu podobny efekt obserwowano jedynie dla stężeń wysokich: 20 i 30 µmol/l. Rezweratrol i kwercetyna w stężeniach 5 i 10 µmol/l wykazywały tendencję do łagodzenia toksycznego działania metalu. Oznaczenia aktywności kaspazy-3 nie przyniosły statystycznie istotnych zmian dla komórek inkubowanych z jonami glinu. W próbach z manganem obserwowano znaczący wzrost aktywności kaspazy-3 dla komórek eksponowanych na wpływ metalu. Polifenole wykazywały działanie protekcyjne, w każdym stężeniu zmniejszając intensywność apoptozy.Badanie aktywności LDH i test redukcji MTT potwierdziły neurotoksyczne działanie jonów glinu i manganu. Oznaczenie kaspazy-3 pozwoliło dodatkowo rozróżnić odmienne dla obu metali mechanizmy śmierci komórek: apoptoza dla manganu i przewaga procesów nekrotycznych w przypadku glinu. Wyniki uzyskane dla prób w narażeniu na mangan z dodatkiem polifenoli wydają się sugerować następującą prawidłowość: w stężeniach do 10 µmol/l rezweratrol i kwercetyna działają neuroprotekcyjnie, zaś w stężeniach wyższych nasilają działanie uszkadzające komórki nerwowe.