Rola apoptotycznej i nieapoptotycznej śmierci komórek białaczkowych indukowanej działaniem kurkuminy i etopozydu

Wstęp: Kurkumina jest kurkuminoidem izolowanym z kłączy ostryżu długiego (Curcuma longa, L.), który posiada udowodnione działanie przeciwnowotworowe. Pomimo że kurkumina znana jest jako typowy związek o działaniu pro-apoptotycznym, szczegółowe mechanizmy wywoływania śmierci komórkowej nie są do końca poznane. Cel badań: Celem niniejszej pracy była analiza ilościowa udziału apoptozy i nieapoptotycznej śmierci komórkowej w populacji komórek HL-60 inkubowanych z kurkuminą i/lub etopozydem. Metodyka: Badania wykonywano na komórkach linii ostrej białaczki szpikowej HL-60 inkubowanej z różnymi stężeniami kurkuminy i/lub etopozydu przez 24 godziny. Stosowano także preinkubację komórek z inhibitorem kaspaz o szerokim spektrum działania Z-VAD-FMK, a następnie inkubowano je z kurkuminą. Po inkubacji komórki barwiono aneksyną V sprzężoną z allofikocyjaniną (APC) oraz jodkiem propidyny. Na cytometrze przepływowym analizowano ilość komórek żywych, apoptotycznych i nekrotycznych. Ponadto, wykonywano preparaty cytologiczne komórek po inkubacji z badanymi związkami i barwiono je metodą Giemsy. Następnie przeprowadzono analizę ilościową i jakościową komórek pod mikroskopem świetlnym. Na podstawie obrazów mikroskopowych porównywano działanie kurkuminy i etopozydu oraz analizowano wpływ kombinacji tych związków w komórkach HL-60. Wyniki i wnioski: Wyniki cytometrycznej analizy komórek inkubowanych z kurkuminą i inhibitorem kaspaz Z-VAD-FMK potwierdziły zdolność tego polifenolu do wywoływania nieapoptotycznej śmierci komórkowej, w sposób zależny od stężenia. Obraz morfologiczny komórek po barwieniu metodą Giemsy wskazywał, iż poza apoptozą kurkumina wywołuje śmierć nekrotyczną komórek, która dominowała po inkubacji z wyższym stężeniem kurkuminy (50 µM). Zaobserwowano również obecność mikrojąder po inkubacji komórek z kurkuminą, świadczących o zdolności tego polifenolu do wywoływania zaburzeń kariokinezy, które mogą prowadzić do mitotycznej katastrofy. Niższe stężenie kurkuminy (20 µM) indukowało zarówno apoptozę, jak i nekrozę, podobnie jak etopozyd. Natomiast wyższe stężenie kurkuminy (50 µM) różniło się od etopozydu rodzajem wywoływanej śmierci komórkowej. Kombinacja kurkuminy i etopozydu powodowała zarówno apoptozę, jak i nekrozę komórek, podobnie jak sam cytostatyk. Biorąc pod uwagę, iż kurkumina może w znacznym stopniu indukować nekrozę komórek HL-60, można przypuszczać, że będzie ona odgrywała znaczącą rolę w uśmiercaniu komórek opornych na apoptozę.

Introduction: Curcumin is a curcuminoid obtained from the rhizome of the turmeric (Curcuma longa, L.) that has been shown to have antineoplastic properties. Though considered a typical “pro-apoptotic” compound, its exact mechanisms resulting in cell death are not completely understood yet. Aim of study: The aim of this thesis was the quantitive analysis of apoptotic and non-apoptotic cell death in curcumin and/or etoposide-induced HL-60 cells. Methods: The study was performed on the acute leukemia HL-60 cells incubated with different concentrations of curcumin and/or etoposide for 24 hours. The preincubation with broad-spectrum caspase inhibitor Z-VAD-FMK followed by incubation with curcumin was also performed. After incubation the cells were stained with the conjunction of annexine V and allophycocyanin (APC) and propidium iodide (PI). The number of living, apoptotic and necrotic cells was analyzed with flow cytometry. Additionaly, the cytology smears of cells incubated with curcumin and/or etoposide were prepared and stained with Giemsa stain. This was followed by quantitive and qualitative analysis of celles under optical microscope. Basing on microscopy images, the action of curcumin and etoposide was compared and the influence of the combination of those two compounds on HL-60 cells was analyzed. Results and conclusions: The results of flow cytometry analysis of the cells incubated with caspase inhibitor Z-VAD-FMK and curcumin, validated the ability of this polyphenol to cause non-apoptotic cell death, in a concentration-dependent manner. The morphological image of the cells after Giemsa staining indicated that apart from apoptosis, curcumin induces necrotic cell death which was significant after the cells were incubated with higher (50 µM) concentration of curcumin. After incubation of the cells with curcumin, the micronuclei formation was observed, which suggests the ability of the investigated polyphenol to cause karyokinesis disturbances which may lead to mitotic catastrophe. Lower concentration of curcumin (20 µM) induced both apoptosis and necrosis, same as etoposide. By contrast, higher concentration of curcumin (50 µM) caused different from etoposide type of cell death. The combination of curcumin and etoposide caused both apoptosis and necrosis of the cells, same as etoposide while used separately. Taking under consideration that curcumin can induce necrosis of the HL-60 cells in a significant manner, it may be assumed that it would play an important role in killing those cells that are resistant to apoptosis.