Zastosowanie obrazowania FTIR do wyznaczenia markerów stanu dysfunkcji komórek

Conducting intensive research on tumor cells and tumor leads to knowledge about the mechanisms of cancer and predicting its further changes. It is very important to get the ability to detect cancerous changes at the level of individual cells, which would increase the effectiveness of cancer diagnosis. The aim of the research was to determine changes in IR specta of the state of endhothelial dysfunction treated with tumor necrosis factor (TNFa, pl. Czynnik Martwicy Nowotworu) comparing to control cells. Performing FTIR imaging in standard (with pixel size of 5,5um) and high (with pixel size of 1,1um) spatial resolution allowed to identify characteristic bands of the action of TNFa on endothelial cells EA.hy926 and HLMVEC. Measurements were carried out with spectral resolutions of 6 cm-1 and 8 cm-1 using transmission and transflection techniques. FTIR spectra from standard magnification were analyze by UHCA (Unsupervised Hierarchical Cluster Analysis) and from high magnification by KMC (k-Means Clustering). UHCA method was used to extract chemical image of whole cells. While KMC analysis extracted classes of the central (nucleus and and the nearest environment) and peripheral (mainly cytoplasm) parts of cells. After HCA/KMC analysis, mean FTIR spectra were used to calculate a level of discrimination using PCA (Principal Component Analysis) and finally to construct charts of chemical changes in cells induced by TNFα vs control. Results provided general chemical information about the effect of tumor necrosis factor on endothelial cells. FTIR imaging enables the analysis of changes in cell components such as lipids, proteins, sugars and nucleic acids.

Prowadzenie badań nad nowotworami zwiększa możliwość ich wykrycia na poziomie pojedynczych komórek nowotworowych. Celem pracy było wyznaczenie spektralnych markerów stanu dysfunkcji komórek śródbłonka Ea.hy926 i HLMVEC w odpowiedzi na działanie czynnika zapalnego TNFa. Przeprowadzenie pomiarów w trybie standardowej (rozmiar piksela ~5,5um) i wysokiej (rozmiar piksela ~1,1um) rozdzielczości przestrzennej umożliwiły identyfikację charakterystycznych pasm dla działania TNFa. Obrazowanie prowadzono z rozdzielczością 6 cm-1 i 8 cm-1, używając techniki transmisji i transfleksji. Uzyskane widma FTIR analizowano z wykorzystaniem metody Hierarchicznej Analizy Skupień (ang. Hierarchical Cluster Analysis, HCA) oraz Analizy Skupień k-Średnich (ang. k-Means Clustering. KMC). Analiza metodą HCA pozwoliła na wyodrębnienie klasy komórek, a przy pomocy analizy KMC wyodrębniono klasę odpowiadającą zewnętrznej (głównie cytoplazma) i centralnej części komórek (jądro i najbliższe otoczenie). Przeprowadzona następnie analiza głównych składowych (ang. Principal Cluster Analysis, PCA) pozwoliła na przeanalizowanie zmienności głównych elementów próbki oraz redukcję zmiennych. Otrzymane wyniki jak i skonstruowane wykresy porównawcze komórki kontrolne vs komórki inkubowane TNFa wykazały, że TNFa silniej działa na zewnętrzne części komórek, co obserwowane jest na widmach jako spadek intensywności m.in: pasm lipidowych czy pasma amidowego I. Dodatkowo wykazano różnice między wynikami uzyskanymi w trybie transmisji i transfleksji. Obrazowanie FTIR umożliwiło analizę widm biokomponentów, tj. lipidów, białek, kwasów nukleinowych czy cukrów występujących w komórkach.