ADAM17 silencing in cell line Pan02

ADAM17 (A disintergrin and metalloproteinease-17) is an enzyme which catalyses transmembrane protein hydrolysis. Its substrates include molecules, which have different functions, like cytokines, grow factors, their receptors and cell adhesion molecules. The products of ADAM17 shedding can influence carcinogenesis and metastasis process.The aim of the study was to evaluate the function of ADAM17 in murine pancreatic adenocarcinoma cell Pan02. The thesis demonstrates that ADAM17 silencing influences cell sensitivity to cytokines, NO production, transcription factor activation and single cell motility.Pan02 cells were transducted with a lentivirus with ADAM17-silencing sequences. Two of the generated cells lines were used in the experiments– the first with one shRNA sequence S2 (PanS2) and the second with two shRNA sequences, S2 and S3 (PanS2/3). The reduced level of ADAM17 protein expression was demonstrated by Western Blotting. Cell sensitivity to proinflammatory factors was tested by MTT assay. The results of the Cell metabolic activity assay after stimulation show that the cell line PanS2/3 is the most sensitive. That cell line has also a tendency to produce more NO after stimulation. Nuclear protein assay shows that AP-1 activation was decreased in cells after ADAM17 silencing. Migration assays show that only PanS2 cells were more motile than control. The results show that ADAM17 can influence sensitivity of Pan02. to proinflammatory factors, AP-1 activation and cell motility.

ADAM17 (A disintergrin and metalloproteinease-17) jest enzymem, który katalizuje hydrolizę białek błonowych o bardzo różnych funkcjach. Do substratów tego enzymu należą cytokiny, czynniki wzrostu, ich receptory oraz białka adhezyjne. Ich proteoliza może wpływać na procesy nowotworzenia oraz metastazy.W przeprowadzonych badaniach sprawdzano jaką rolę odgrywa ADAM17 w komórkach mysiego gruczolaka przewodu trzustki Pan02. Niniejsza praca przedstawia wpływ wyciszenia ADAM17 na wrażliwość komórek na cytokiny, produkcję NO, aktywację czynników transkrypcyjnych oraz migracje pojedynczych komórek.Do Pan02 wprowadzono w transdukcji lentiwirusowej sekwencje wyciszające dla ADAM17. Uzyskano dwie linie komórkowe – jedna zawierająca jedną sekwencję wyciszającą shRNA S2 (PanS2), druga z dwoma shRNA S2 i S3 (PanS2/3). Wykazano wyciszenie ekspresji ADAM17 na poziomie białka metodą Western Blotting.Wrażliwość komórek na czynniki prozapalne oceniano w teście MTT. Wyniki aktywności metabolicznej komórek po stymulacji wskazały, że najbardziej wrażliwa na TNFα oraz jego kombinacje z IL-1β lub IFNγ jest linia uzyskana po wyciszeniu dwoma liniami shRNA. Linia ta wykazuje tendencję do zwiększonej produkcji NO po stymulacji tymi samymi czynnikami.Badanie frakcji jądrowych metodą EMSA wskazało, że w komórkach z wyciszonym ADAM17 aktywacja AP-1 została obniżona. Transdukcja lentiwirusowa dwoma sekwencjami wyciszającymi przynosi mniejszy efekt inhibicji AP-1 niż transdukcja z pojedynczą sekwencją. W linii PanS2 jest również widoczne osłabienie aktywacji AP-1 po działaniu TNFα.W ocenie migracji komórek odnotowano w linii PanS2 zwiększoną szybkość migracji pojedynczych komórek. W linii PanS2/3 nie występuje znacząca zmiana w tempie przemieszczania się względem kontroli.Uzyskane wyniki wskazują na wpływ obecności ADAM17 na wrażliwość komórek Pan02 na czynniki prozapalne, aktywacje AP-1 i migrację komórek.