Otrzymanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z fibroblastów pochodzących z myszy dystroficznych z wykorzystaniem indukowanych doksycykliną policistronowych wektorów lentiwirusowych regulowanych systemem Cre/LoxP

Dystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD) jest rzadką chorobą genetyczną sprzężoną z chromosomem X, której przyczyną jest mutacja w genie kodującym dystrofinę. Wraz z rozwojem choroby obserwowana jest postępująca degeneracja i osłabienie mięśni. Kardiomiopatia oraz dysfunkcje mięśni oddechowych należą do głównych przyczyn śmierci pacjentów przed 30. rokiem życia, a stosowane terapie maja na celu jedynie złagodzenie objawów dystrofii. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs) mogą stanowić niezwykle cenne narzędzie nie tylko do badania mechanizmów tej choroby, lecz również do testowania nowych metod terapii. iPSCs to pluripotencjalne komórki macierzyste, które mogą zostać otrzymane z komórek somatycznych przez nadekspresję czterech czynników transkrypcyjnych: Oct4, Sox2, Klf2 and c-Myc (OSKM). W niniejszej pracy, fibroblasty wyizolowane z myszy będących modelem dystrofii mięśniowej Duchenne’a (myszy mdx) zostały reprogramowane do iPSCs z wykorzystaniem indukowanych doksycykliną policistronowych wektorów lentiwirusowych kodujących wszystkie cztery czynniki OSKM i regulowanych systemem Cre/LoxP. Otrzymane iPSCs tworzyły kolonie o morfologii typowej dla mysich zarodkowych komórek macierzystych oraz posiadały aktywność alkalicznej fosfatazy. Analiza RT-PCR pokazała, że komórki te wykazują ekspresję takich markerów pluripotencji jak Nanog, Sall4 oraz Rex1, z kolei barwienie immunofluorescencyjne uwidoczniło obecność markerów SSEA-1, Oct4 oraz Nanog w iPSCs otrzymanych z fibroblastów kontrolnych i dystroficznych. Ponadto, otrzymane iPSCs formowały ciałka zarodkowe i były zdolne do spontanicznego różnicowania w komórki pochodzące z trzech listków zarodkowych. Dalsze badania będą miały na celu charakterystykę kontrolnych i dystroficznych mioblastów, pochodzących z różnicowania opisywanych iPSCs.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a rare X-linked recessive genetic disorder caused by a mutation in gene encoding dystrophin. In consequence, progressive muscle degeneration and weakness, mainly cardiomyopathy and respiratory muscle dysfunction occur leading to death at late twenties. Since there is no cure available for DMD, induced pluripotent stem cells (iPSCs) seem to be invaluable tool to investigate the mechanisms of the disease and to apply different strategies of the treatment. iPSCs are a type of pluripotent stem cells which can be generated from somatic cells by overexpression of four transcription factors: Oct4, Sox2, Klf2 and c-Myc (OSKM). In this study, fibroblasts isolated from Duchenne muscular dystrophy model (mdx) mice were reprogrammed into iPSCs using the doxycycline (dox)-inducible Cre/LoxP-regulated polycistronic lentiviral vector encoding all four OSKM factors. Obtained iPSCs grow in colonies demonstrating morphology typical for mouse embryonic stem cells and are positive for alkaline phosphatase activity. RT-PCR analysis confirmed expression of pluripotency markers such as Nanog, Sall4 and Rex1, whereas immunofluorescent staining revealed the presence of markers: SSEA-1, Oct4 and Nanog in control and mdx iPSCs. Additionally, these cells were able to form embryoid bodies and spontaneously differentiate in vitro into all three germ cell lineages. Further studies will employ this potential to investigate the properties of control and dystrophin-lacking myoblasts differentiated from described iPSCs.