The application of fluorescence anisotropy to study the effect of pathogenic mutations T372R and D380Y on the interaction between the N- and C-terminal fragments of the YY1 protein

Celem pracy było zbadanie wpływu chorobotwórczych mutacji punktowych T372R i D380Y na oddziaływanie między C i N końcem ludzkiego białka YY1 z wykorzystaniem anizotropii fluorescencji. Do plazmidu pET21a zawierającego gen ludzkiego białka YY1 w formie dzikiej, wprowadzano mutację punktową D380Y z wykorzystaniem metody QuickChange. Do tak uzyskanego konstruktu oraz do analogicznego plazmidu niosącego mutację T372R wprowadzano mutacje zmieniając reszty seryny 14 na cysteinę. Szczep E.coli origami pLysS stransformowano uzyskanymi plazmidami, indukowano ekspresję, wyizolowano białko. Proces oczyszczania przeprowadzono na złożu NiNTA w warunkach denaturujących, przeprowadzono fałdowanie białka podczas dializy a następnie oczyszczono preparat na złożu IgH-seph w warunkach natywnych. Oczyszczone białka wyznakowano maleimidem fluoresceiny w pozycji C14. Wykonano pomiary anizotropii fluorescencji dla wyznakowanych białek we wzrastającym stężeniu soli. Pomiar ten pozwala na określenia wpływu mutacji punktowych na oddziaływanie C i N końca białka.

The main focus of this study was to investigate the effect of pathogenic mutations T372R and D380Y on the interaction between the N- and C-terminal fragments of the YY1 protein. QuickChange method was used to insert a point mutation D380Y into plasmid with wild type human YY1 protein. Additional S14C mutations were inserted to D380Y and analogous plasmid with T372R mutation. E. coli orgami pLysS strain was transformed with both plasmids and used for protein expression. Proteins were purified with affinity chromatography, first using NiNTA column in denaturing conditions, followed by refolding during dialysis and purifying on DNA-affinity IgH-seph column. Proteins were labeled using fluorescent dye fluorescein maleimide. Fluorescence anisotropy measurement was performed in increasing concentration of salt in order to investigate impact of mutations on N- and C- terminal fragments interaction.