Recombinant protein TBPc C262S - mutagenesis, expression, purification

TBP is one of the major eukaryotic transcription factors. It is responsible for recognizing TATA-box sequence located on the promoter. TBP-DNA interaction is the initial phase of transcription. It is said that the C-terminal domain of the protein can interact with other transcription factors like Yin Yang 1, but the nature of this phenomenon is not well known. Fluorometry is one of the methods to study this interaction profoundly.Obtaining recombinant, point-mutated TBPc protein through replacing cysteine by serine residue at position 262 can allow labelling the protein with fluorescence dye more selectively, hence studying the interaction between TBPc and YY1 in a more precise way by fluorometric methods. Therefore, the mutation in the coding sequence of the protein was introduced, followed by expression and purification processes.The studies allowed to obtain the protein only as insoluble inclusion bodies. Optimisation of expression and purification methods should lead to obtain TBPc mutants in the future.

TBP jest jednym z głównych eukariotycznych czynników transkrypcyjnych. Białko to odpowiada za rozpoznanie sekwencji TATA znajdującej się w obrębie promotora. Interakcja pomiędzy TBP a DNA jest początkowym etapem transkrypcji. Okazuje się, że domena C-końcowa białka TBP (TBPc) może oddziaływać z innymi czynnikami transkrypcyjnymi, jak np. Yin Yang 1, jednak charakter tego zjawiska nie jest dokładnie poznany. Jednym ze sposobów badania oddziaływania tych białek jest fluorymetria.Uzyskanie zrekombinowanego białka TBPc z mutacją punktową zamieniającą resztę cysteiny na serynę w pozycji 262 może pozwolić na bardziej selektywne wyznakowanie białka znacznikiem fluorescencyjnym, a w konsekwencji, przeprowadzenie dokładniejszych badań oddziaływania pomiędzy TBPc a YY1 z wykorzystaniem metod fluorymetrycznych. W związku z tym, wprowadzono pożądaną mutację w sekwencję kodującą białka, następnie przeprowadzono procesy ekspresji i oczyszczania.Przeprowadzone badania pozwoliły na uzyskanie białka tylko w formie nierozpuszczalnych ciałek inkluzyjnych. Zoptymalizowanie metod ekspresji i oczyszczania powinno doprowadzić do otrzymania mutantów TBPc w przyszłości.