Optimalization of crystallization conditions for bovine pancreatic trypsin

Podczas procesu krystalizacji białek, na wynik danego procesu ma wpływ wiele parametrów z których niektóre można kontrolować, natomiast inne są trudne do powtórzenia. Problemy związane z procesem krystalizacji mogą się pojawić w przypadku otrzymania bliźniaczych lub heterogenicznych kryształów, nie nadających się do przeprowadzenia badań dyfrakcyjnych. Zarodkowanie jest jedną z technik używaną do przezwyciężenia tych problemów. W ramach przeprowadzonych badań optymalizowano krystalizację trypsyny w celu otrzymania kryształów o wysokiej symetrii, niezbędnej do uzyskania kompletnych danych krystalograficznych. Początkowe eksperymenty związane z optymalizacją krystalizacji trypsyny bazowały na warunkach pobranych z czterech publikacji. W ramach optymalizacji krystalizacji zmieniano stężenia roztworów krystalizacyjnych. precypitantów i buforów. Przeprowadzając serie eksperymentów, trypsynę krystalizowano metodą wiszącej kropli, modyfikowaną następnie poprzez zarodkowanie. W wyniku 250 przeprowadzonych eksperymentów otrzymano homogeniczne, regularne kryształy z których największy miał rozmiar 0.15mm x 0.1mm x 0.1mm określony na podstawie badań dyfrakcyjnych.

Protein crystallization is affected by many parameters, among which certain parameters can be easily controlled but other are difficult to reproduce. Therefore common problems can occur as a result of crystallization including multiple or twin crystals and poorly diffracting crystals. One of the techniques used to overcome these problems is seeding method. The main goal of this work was to obtain bovine pancreatic trypsin crystals of high symmetry, in order to achieve the complete data sets from the high-pressure crystallography structural tests. A starting point for the optimization of the trypsin crystallization conditions was based on four original papers. Starting conditions were optimized by changing the protein solution, precipitants and buffers concentration. Number of standard hanging-drop experiments were followed by the seeding experiments. As a result of 250 experiments, well-shaped trypsin crystals of orthorhombic symmetry with size 0.15 mm x 0.1mm x 0.1 mm were successfully obtained.