Zastosowanie pomiaru fluorescencji tryptofanu do oceny stabilności termodynamicznej monoklonalnych wolnych łańcuchów lekkich immunoglobulin

Immunoglobuliny to białka o budowie domenowej. Składają się z łańcuchów ciężkich oraz lekkich. Każdy z nich zawiera część stałą wspólną dla wszystkich oraz cześć zmienną, która jest niepowtarzalna, dzięki rekombinacjom genetycznym. Przeciwciała produkowane są przez komórki plazmatyczne, czyli pobudzone limfocyty B i stanowią ważny element układu odpornościowego. Jednak w sytuacjach patologicznych może dojść do nadprodukcji wolnych łańcuchów lekkich oraz ich agregacji w formie włókien amyloidowych lub bezpostaciowych depozytów. Występują one w wielu schorzeniach takich jak: amyloidozy łańcuchów lekkich, choroba depozytowa łańcuchów lekkich, nabyty zespół Fanconiego czy nefropatia. W diagnostyce tych schorzeń ważną rolę pełni oznaczenie stężenia wolnych łańcuchów lekkich w surowicy lub moczu. Stabilność łańcuchów lekkich ma duże znaczenie w procesie ich agregacji. Ze względu na dużą liczbę wariantów sekwencji zaangażowanych w tworzenie łańcuchów lekkich i ogromną różnorodność immunoglobulin, wielkim wyzwaniem jest zrozumienie przyczyn i mechanizmu agregacji. Dlatego podejmowane są liczne badania nad ich stabilnością termodynamiczną oraz skłonnością do tworzenia się depozytów. Do najczęściej stosowanych technik pomiaru należą dichroizm kołowy, skaningowa kalorymetria różnicowa, skaningowa fluorymetria różnicowa oraz pomiar fluorescencji tryptofanu zawartego w białku. Tryptofan jako aminokwas zawierający pierścień aromatyczny wykazuje własną fluorescencję. Umożliwia to pomiar białek mających w swoim składzie ten aminokwas. W niniejszej pracy wybrano właśnie metodę pomiaru fluorescencji do zbadania stabilności termodynamicznej wolnych łańcuchów lekkich obecnych w moczu pacjentów z gammapatiami monoklonalnymi. Metoda ta posiada wiele zalet. Może być wykorzystywana do monitorowania reakcji rozwijania białka wywołanej wysoką temperaturą, chemiczną denaturacją lub ciśnieniem. Wysoka czułość umożliwia precyzyjne śledzenie interakcji między poszczególnymi cząsteczkami oraz ich otoczeniem. Te właściwości pozwalają na kliniczne zastosowanie pomiaru fluorescencji. Jako czynnik denaturujący zastosowano łatwo dostępny roztwór mocznika. Badania wykazały znaczną heterogenność wolnych łańcuchów lekkich pod względem stabilności termodynamicznej. Decydujący wpływ na stabilność termodynamiczną ma budowa określonego klonu łańcuchów i jest to sprawa bardzo indywidualna i charakterystyczna. Do lepszego poznania cech wolnych łańcuchów lekkich oraz ich znaczenia w procesie chorobowym konieczne są dalsze badania przeprowadzone na szerszej grupie pacjentów.

Immunoglobulins are proteins which have the domain construction. They consist of heavy and light chains. Each of them contains the permanent part shared for everyone and the changeable reverence which is unique, thanks to genetic recombinations. Antibodies are produced by plasma cells, i.e. stimulated B lymphocytes and constitute the important component of the immunological system. However, in pathological situations, it can lead to overproduction of free light chains and their aggregation in the form of amyloid fibers or amorphous deposits They occur in many conditions such as: light chain amyloidosis, light chain deposition disease, acquired Fanconi syndrome or nephropathy. Very important role in the diagnostics of these diseases has the concentration of free light chains in serum or urine. The stability of light chains is outweighing in the process of their aggregation. Due to the large number of sequence variants involved in creating light chains and a huge variety of immunoglobulins, the big challenge is to understand the causes and mechanism of aggregation. So are a number of studies of their thermodynamic stability and the tendency to the formation of deposits. The most commonly used measurement techniques include circular dichroism, differential scanning calorimetry, differential scanning fluorimetry, and fluorescence measurement of tryptophan contained in the protein. Tryptophan as an amino acid containing an aromatic ring has its own fluorescence. This allows you to measure the proteins that have this amino acid in your composition. Fluorescence measurement has been chosen in this study to investigate the thermodynamic stability of free light chains present in the urine of patients with monoclonal gammopathies. This method has many advantages. It can be used to monitor the reaction of protein development caused by high temperature, chemical denaturation or pressure. High sensitivity allows you to track interactions between molecules and their surroundings. These properties allow for the clinical use of fluorescence measurement. As the denaturing factor readily available solution of urea was used. Studies have shown significant heterogeneity of free light chains in terms of thermodynamic stability. The decisive influence on thermodynamic stability is the construction of a specific chain clone and it is a very individual and characteristic matter. Further studies on the broader spectrum of patients are needed to better understand the characteristics of free light chains and their importance in the disease process.