S. aureus jest częstym czynnikiem etiologicznym zakażeń skóry i tkanki podskórnej, krwi, układu oddechowego, układu pokarmowego, układu moczowo-płciowego i układu ruchu.Szacuje się, że ok. 30% populacji ludzi zdrowych to nosiciele S. aureus. Zdrowi nosiciele szczepów MRSA, w środowisku szpitalnym mogą jednak stać się źródłem epidemii wywołanej szczepami wielolekoopornymi.Niepokojącym zjawiskiem, staje się nosicielstwo metycylino-opornych szczepów S. aureus (MRSA). Powszechne stosowanie mupirocyny w eradykacji nosicielstwa S. aureus przyczyniło się do wykształcenia przez te szczepy mechanizmu oporności na ten lek. Celem niniejszej pracy było określenie częstości nosicielstwa S. aureus w górnych drogach oddechowych pacjentów leczonych ambulatoryjnie, występowania metycylino- i mupirocyno-oporności wśród tych szczepów oraz porównanie metod służących do identyfikacji S. aureus.W kierunku nosicielstwa S. aureus przebadano 81 materiałów diagnostycznych pobranych z górnych dróg oddechowych, które pochodziły od 29 pacjentów zgłaszających się do Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek w Krakowie. W identyfikacji stosowano klasyczne metody fenotypowe, testy biochemiczne oraz metody molekularne. Z zastosowaniem metody dyfuzyjno-krążkowej, dokonano oceny wrażliwości badanych szczepów na antybiotyki takie jak: erytromycyna, klindamycyna, cefoksytyna, tetracyklina i mupirocyna oraz oceny ewentualnej obecności mechanizmów oporności.Identyfikacja fenotypowa S. aureus obejmowała makroskopową ocenę wzrostu na agarze z 5% krwią baranią, ocenę mikroskopową preparatów barwionych metodą Grama, ocenę fermentacji mannitolu na podłożu Chapmana oraz testy określające zdolność do wytwarzania katalazy, czynnika clumping factor i koagulazy wolnej. Wykonano także testy biochemiczne API Staph. Obecność szczepów opornych na metycylinę identyfikowano przy użyciu podłoża chromogennego. Metody molekularne obejmowały reakcję amplifikacji genów 16S rRNA, mecA, femB oraz genotypowanie metodą RAPD-PCR z wykorzystaniem sekwencji starterowej ERIC-2. W badaniu potwierdzono nosicielstwo u 13 pacjentów (44,8% grupy badanej). Nosicielstwo S. aureus w nosogardzieli stwierdzono u 17,24% pacjentów, natomiast w nosie u 41,48% pacjentów. Wśród badanych szczepów 3 (12,5%) wykazały oporność na cefoksytynę (MRSA), natomiast 1 (4,16%) wykazał oporność na tetracyklinę. Żaden z badanych szczepów S. aureus nie wykazał oporności na mupirocynę. Badane szczepy analizowano także pod względem występowania mechanizmu oporności MLSB. Spośród wszystkich badanych szczepów 1 (4,16%) wykazywał oporność zarówno na erytromycynę, jak i klindamycynę, czyli konstytutywny fenotyp mechanizmu oporności MLSB. Dodatkowo, w szczepie tym potwierdzono oporność na cefoksytynę (MRSA).W badaniach molekularnych wykorzystujących amplifikację genów 16S rRNA oraz genu mecA, gatunek S. aureus został potwierdzony u wszystkich 24 szczepów. Metycylino-oporność została potwierdzona dla 3 szczepów, u których ten mechanizm oporności wykazano także w badaniach fenotypowych. U pozostałych szczepów nie potwierdzono obecności produktu reakcji dla genu mecA.U wszystkich wyizolowanych szczepów wykazano obecność genu femB, co potwierdza ich przynależność do gatunku S. aureus. Wyniki analizy genotypowania metodą RAPD-PCR potwierdziły, że w każdym przypadku izolacji S. aureus z różnych miejsc od tego samego pacjenta, wyizolowane szczepy były identyczne.Wyniki przeprowadzonych badań, potwierdzają, że nosicielstwo wielolekoopornych szczepów S. aureus w populacji ludzi zdrowych jest dosyć częste i wymaga odpowiednio dobranych metod diagnostycznych. Szybka i trafna identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia jest bardzo ważna z punktu widzenia skutecznej antybiotykoterapii. Diagnostyka mikrobiologiczna powinna być zawsze poszerzana o metody molekularne, ze względu na ich dużą czułość i swoistość oraz możliwość wyeliminowania błędnych wyników.
Staphylococcus aureus is one of the most common human pathogen. It cause many infections like skin and subcutaneous tissue, blood, respiratory tract, gastrointestinal tract, genitourinary tract or bones and marrow.The persistent nasal carriage of S. aureus is appraised to affect around 30% of the whole population. In hospitals, healthy carriers of MRSA may became a source of epidemy. An increasingly frequent and disturbing phenomenon is the acquisition of methicillin-resistant S. aureus (MRSA). The widespread use of mupirocin in the eradication of S. aureus infection has led to the development of resistance to this drug by these strains.The aim of this study was to determine the frequency of S. aureus carriage in the upper respiratory tract of ambulatory patients, the occurrence of methicillin- and mupirocin-resistance among these strains, and to compare the methods used to identify S. aureus.To detect S. aureus carriage, 81 diagnostics materials from the upper respiratory tract were examined. Materials were taken from 29 patients reporting to the Center for Microbiological Research and Autovaccines in Cracow. Phenotypic methods, biochemical tests and molecular methods were used in the identification of S. aureus. The disc-diffusion method was used to evaluate antibiotic susceptibility of erythromycin, clindamycin, cefoxitin, tetracycline and mupirocin and possible presence of resistance mechanisms. The S. aureus phenotypic identification included macroscopic assessment of growth with 5% sheep blood, microscopic evaluation of Gram-stained preparations, evaluation of mannitol on Chapman's medium, and tests for catalase, clumping factor and free coagulase. Biochemical tests API Staph were also performed. The presence of methicillin-resistant strains was identified using the chromogenic medium. Molecular methods involved amplification of 16S rRNA, mecA, femB genes and RAPD-PCR genotyping using the ERIC-2 starter sequence.S. aureus carriage was confirmed in 13 patients (44,8% of the study group). The carrier of S. aureus in nasopharynx was found in 17,24% of patients, while in the nose in 41,48% of patients. Among the tested strains 3 (12,5%) showed resistance to cefoxitin - MRSA phenotype, while 1 (4,16%) showed resistance to tetracycline. It was not a methicillin resistant strain. None of the tested strains of S. aureus showed resistance to the mupirocin.Strains were also tested for the presence of the MLSB resistance mechanism. One (4,16%) of the all tested strains showed resistance to both erythromycin and clindamycin, what indicate the constitutive phenotype of the MLS_B resistance mechanism. In addition, the strain has been shown to be resistant to cefoxitin (MRSA).In molecular studies using 16S rRNA gene amplification and mecA gene, S. aureus species was confirmed in all 24 strains. Methicilin-resistance was confirmed for 3 strains in which the mechanism of resistance was also demonstrated in phenotypic studies. In the remaining strains, the presence of a reaction product for the mecA gene was not confirmed.Presence of femB gene was demonstrated in all isolated strains, which confirms their belonging to the species S. aureus.Results of RAPD-PCR genotyping have confirmed that in each case of S. aureus isolation from different sites from the same patient, isolated strains were identical The results of the studies confirmed that the transmission of multi-drug resistant strains of the S. aureus in healthy populations is a widespread and demanding phenomenon. Rapid and accurate identification of the etiologic agent is very important for effective antibiotic therapy and for reducing convalescence time. Microbiological diagnostics should always be extended by molecular methods, due to their high sensitivity and specificity and the possibility of eliminating incorrect results.
