Evaluation of the prognostic value of quantitative analysis of mutation FLT3/ITD in children with acute myeloid leukemia.

Ostra białaczka szpikowa (AML) to choroba, w której dochodzi do nadmiernej proliferacji i kumulacji niedojrzałych morfologicznie oraz czynnościowo komórek blastycznych, wywodzących się z nieprawidłowej, transformowanej nowotworowo komórki prekursorowej linii mieloidalnej. U większości dzieci z AML stwierdza się obecność charakterystycznych zmian cytogenetycznych i mutacji genowych, które decydują o klasyfikacji pacjenta do określonej grupy ryzyka. W efekcie wpływa to na wybór postępowania terapeutycznego, a przede wszystkim na stan pacjenta, przebieg choroby, odpowiedź na leczenie i prawdopodobieństwo niepowodzenia. Jedną z mutacji genowych występujących w AML jest wewnętrzna tandemowa duplikacja w genie FLT3 (FLT3/ITD), która jest obecna u ok. 15 % dzieci chorych na AML. W niniejszej pracy magisterskiej przeprowadzono ocenę wartości rokowniczej ilościowej analizy mutacji FLT3/ITD u dzieci z ostrą białaczką szpikową. Badaniem objęto grupę 27 dzieci z de novo rozpoznaną AML, u których stwierdzono obecność mutacji FLT3/ITD. Pacjenci byli leczeni wg. jednolitego programu terapeutycznego AML-BFM 2004 Interim w ośrodkach Polskiej Pediatrycznej Grupy do Spraw Leczenia Białaczek i Chłoniaków (PPGLBC). Materiał do badań stanowiły próbki szpiku kostnego (27) oraz krwi obwodowej (9). Detekcję produktów reakcji PCR przeprowadzono dwoma metodami: rozdział elektroforetyczny w 3% żelu agarozowym wybarwionym Midori Green DNA Stain oraz rozdział na zasadzie elektroforezy w oparciu o system taśmowy przy użyciu taśmy Agilent D1000 ScreenTape Assay i aparatu 4200 TapeStation System. Wartość otrzymanego w badaniach własnych współczynnika korelacji nieparametrycznej potwierdza przydatność stosowania obu metod do przeprowadzenia tego typu analiz. Badania wykazały, że w przypadku próbek krwi obwodowej analizowanych obiema metodami wyższe wartości stosunku allelu zmutowanego do allelu prawidłowego wiążą się z częstszym występowaniem niepowodzenia leczenia. W przypadku szpiku kostnego obie metody (elektroforeza agarozowa, TapeStation) okazały się nie być idealnym narzędziem do oceny tej zależności. Analiza przeżycia Kaplana-Meiera w przypadku próbek szpiku kostnego wykazała, iż w początkowej fazie znacząco zmniejsza się prawdopodobieństwo przeżycia, czego nie można było jednoznacznie wskazać w odniesieniu do krwi obwodowej. Analiza w oparciu o krzywe ROC pozwoliła na wyznaczenia punktów odcięcia, pozwalających na kwalifikacje dzieci do grup w zależności możliwości wystąpienia niepowodzenia leczenia. Niestety uzyskane wyniki nie potwierdziły statystycznie istotnych zależności obu zastosowanych metod analizy ilościowej w próbkach szpiku kostnego. Natomiast w przypadku krwi obwodowej krzywe ROC dla obu stosowanych metod analizy ilościowej potwierdziły wysoką dokładność i przydatności klasyfikacji (AUC wyniosło 0,857). W kolejnych analizach przeżycia metodą Kaplana-Meiera, na podstawie wartości proponowanego punktu odcięcia otrzymanego z krzywej ROC, dzieci z AML zostały podzielone na dwie grupy. W próbkach szpiku kostnego analizowanego metodą TapeStation, w grupie o wyższych wartościach ratio obserwowano w początkowej fazie zmniejszone prawdopodobieństwo oraz krótszy czas przeżycia wolnego od niepowodzeń leczenia. W próbkach krwi obwodowej analizowanej obiema metodami w grupie o niższej wartości ratio obserwowano na początku spadek prawdopodobieństwa przeżycia wolnego od niepowodzeń do 50%, który następnie utrzymywał się na stałym poziomie. Czas przeżycia wolnego od niepowodzeń leczenia był dłuższy w tej grupie niż w grupie o wyższych wartościach ratio. Wyniki te nie były istotne statystycznie (p>0,05). Dalsza analiza problemu wymaga zwiększenia grupy pacjentów, szczególnie w przypadku materiału jakim jest krew obwodowa oraz standaryzacji stosowanych metod ilościowej oceny poszczególnych alleli genu FLT3, co w efekcie może przyczynić się do wyodrębnienia nowego czynnika prognostycznego w dziecięcej AML.

Acute myeloid leukemia (AML) is a disease with an excessive proliferation and accumulation of morphologically and functionally immature blasts, derived from an abnormal, transformed myeloid progenitor cell. Most children suffering from AML have characteristic cytogenetic abnormalities and gene mutations that determine the patient's classification to a specific risk group. As a result, it affects the choice of therapeutic treatment, the patient's condition, course of the disease, response to the treatment and probability of failure. One of the gene mutations present in AML is internaltandem duplication FLT3 gene (FLT3/ITD), which appears in about 15% of children with AML. In the present study, evaluation of the prognostic value of quantitative analysis of mutation FLT3/ITD in children with AML has been carried out. The study group included 27 children with de novo diagnosed AML who had FLT3/ITD mutation. All of them were treated according to protocol AMF-BFM 2004 Interim in 14 centers of Polish Pediaric Leukaemia/Lymphoma Study Group (PPLLSG). Samples of bone marrow (27) and peripheral blood (9) were analyzed material. Detection of PCR products was carried out using two methods: electrophoretic separation in 3% agarose gel stained with Midori Green DNA Stain and electrolysis separation by tape system using Agilent D1000 ScreenTape Assay and the 4200 TapeStation System. The value of the non-parametric correlation coefficient obtained in our own tests, confirms the usefulness of using both methods to perform those analyses. Our studies have shown that in the peripheral blood samples analyzed using both methods, higher values of the allelic ratio are associated with more frequent failure of treatment. In the bone marrow, both methods proved that they are not perfect to evaluate this relationship. Kaplan-Meier survival analysis for bone marrow samples showed that the survival probability significantly decreased in the initial phase, which could not be clearly identified with peripheral blood. Analysis based on the ROC curves allowed to set cut-off points which allow to qualify children to groups depending on the possibility of treatment failure. Unfortunately, the results did not confirm the statistically significant relationships between the two quantitative methods used in bone marrow samples. In peripheral blood the ROC curves for both used methods confirmed the high accuracy and usefulness of the classification (AUC was 0,857). In another Kaplan-Meier survival analyses, based on the value of the proposed cutoff point obtained from the ROC curve, children with AML were divided into two groups. In bone marrow samples analyzed by TapeStation, in group with higher allelic ratio, we observed decreased probability and shorter survival time of failure-free treatment in the initial phase. In peripheral blood samples analyzed by both methods in a lower allelic ratio group we stated decrease of probability of failurefree survival to 50% which was stable. TFFS was longer in this group than in the higher allelic ratio group. These results were not statistically significant (p>0,05). Further analysis needs bigger group of patients, especially in samples of peripheral blood. We also need the standarization of all metods used to quantitative evaluation, which may contribute to the isolation of a new prognostic factor in pediatric AML.