Wpływ różnych czynników na zdolność tworzenia porów w modelowych błonach biologicznych przez dżdżownicze białka lyzeninopodobne

The pore-forming ability of earthworms Eisenia-type defense proteins is a very interesting research object, because the similarity of that phenomenon to the pore formation by some bacterial toxins. In this work the influence of factors such as: cholesterol content, sphingomyelin (SM) content, sphingomyelinase - the hydrolyzing enzyme of sphingomyelin, and the presence of polyvalent metals on the ability to form pores in modeled biological membranes such as liposomes were studied. Pore-forming proteins are a part of the immune system of earthworms. For the measurement of poreforming capacity the method of fluorescent label (carboxyfluorescein) release from the inside of liposomes was used. Liposomal membranes were made from controlled composition lipid mixtures. It has been observed that both lowering cholesterol and sphingomyelin content disturb carboxyfluorescein release from liposomes which is caused a decrease in the pore formation capacity. However, the sheer presence of cholesterol does not influence the specific recognition and association of lysine to sphingomyelin. Sphingomyelinase and some polyvalent metal ions (Fe3+ and Mn2+) inhibit the occurrence of this phenomenon. On the other hand, Mg2+ ions does not affect the activity of pore-forming protein. It has been observed, that the hydrolyzing enzyme of sphingomyelin caused carboxyfluorescein leakage from liposomes. Increasing the cholesterol content in the liposomes resulted the stabilization of the biological membrane structure as the carboxyfluorescein release was partially inhibited. During the experiments, the specificity of binding the lysenin-like proteins to SM was confirmed. In liposomes lacking sphingomyelin the release of carboxyfluorescein from liposomes was not observed.

Zdolność porotwórcza białek obronnych dżdżownic z rodzaju Eisenia jest bardzo interesującym obiektem badań, m.in. ze względu na podobieństwo tego mechanizmu do tworzenia porów przez niektóre toksyny bakteryjne. W niniejszej pracy zbadano wpływ takich czynników jak: zawartość cholesterolu, sfingomieliny (SM), sfingomielinazyenzymu hydrolizującego sfingomielinę, a także obecność metali wielowartościowych na zdolność tworzenia porów w modelowych błonach biologicznych jakimi są liposomy. Białka porotwórcze stanowią u dżdżownic element układu immunologicznego. Do pomiarów zdolności porotwórczych wykorzystano metodę wypływania znacznika fluorescencyjnego (karboksyfluoresceiny) z wnętrza liposomów. Błony liposomalne sporządzono z mieszanin lipidowych o kontrolowanym składzie. Zaobserwowano, że zarówno obniżenie zawartości cholesterolu jak i sfingomieliny zaburza wypływ karboksyfluoresceiny z liposomów, co spowodowane jest obniżeniem zdolności tworzenia porów. Jednak sama obecność cholesterolu nie ma wpływu na specyficzne rozpoznanie i związanie się lyzeniny do sfingomieliny. Ponadto sfingomielinaza oraz niektóre jony metali wielowartościowych (Fe3+ oraz Mn2+) hamują zachodzenie tego zjawiska. Jony Mg2+ nie wpływają na aktywność białek dziurawiących. Zaobserwowano, że enzym hydrolizujący sfingomielinę powoduje rozszczelnienie liposomów, przez co dochodzi do wycieku karboksyfluoresceiny z ich wnętrza. Podwyższenie zawartości cholesterolu w układzie ze sfingomielinazą powoduje stabilizację struktury błon biologicznych przez co wypływ barwnika fluorescencyjnego jest częściowo hamowany. Podczas przeprowadzonych doświadczeń potwierdzono także specyficzności wiązania się białek lyzeninopodobnych do sfingomieliny, bowiem dochodzi do całkowitego zahamowanie wypływu karboksyfluoresceiny z liposomów, które w swoim składzie nie zawierały sfingomieliny.