Fototropiny (phot) to roślinne fotoreceptory światła niebieskiego/UV-A. Zapewniają one roślinom dostosowanie się do zmiennych warunków środowiska poprzez kontrolowanie szybkich odpowiedzi wzrostowych i ruchów wewnątrzkomórkowych. W genomie Arabidopsis thaliana odkryto dwie fototropiny : PHOT1 i PHOT2. Białka te są podbłonowymi fotoreceptorami. Na N-końcu zawierają dwie domeny LOV, regulowane światłem, tlenem lub zmianą potencjału, które wiążą mononukleotyd flawinowy (FMN). Część C-końcową stanowi domena kinazy serynowo-treoninowej (Ser-Thr). Funkcje fototropin w znacznym stopniu się pokrywają. Kontrolują fototropizm, otwieranie aparatów szparkowych, reakcję akumulacji chloroplastów, rozwój liścieni i liści oraz położenie blaszek liściowych. Natomiast jedynie phot1 pośredniczy w reakcji zahamowania wzrostu hipokotyla oraz odgrywa rolę w procesie destabilizacji transkryptów pod wpływem światła o wysokim natężeniu. Za reakcję ucieczki chloroplastów, ich położenie ciemnościowe oraz pozycjonowanie jądra komórkowego w odpowiedzi na silne światło niebieskie odpowiada tylko phot2. Światło, oprócz kontroli aktywności kinazowej fototropin, moduluje ich ekspresję na poziomie mRNA i białka. W naświetlanych roślinach dochodzi do obniżenia poziomu transkryptu PHOT1, natomiast poziom mRNA PHOT2 wzrasta. U roślin wyższych regulacja ekspresji genów fototropin przez światło znajduje się pod kontrolą fotoreceptorów jądrowych: fitochromów oraz kryptochromów. Celem pracy jest zbadanie stabilności transkryptów PHOT1 i PHOT2 na świetle i w ciemności przy wykorzystaniu Arabidopsis thaliana jako rośliny modelowej. Doświadczenie pozwoli na potwierdzenie bądź wykluczenie wpływu światła na stabilność transkryptów obydwu fototropin dzięki użyciu inhibitora transkrypcji – kordycepiny. Eksperyment doprecyzowuje kwestie związane z mechanizmem regulacji ekspresji fototropin przez światło poprzez określenie czy regulacja ta zachodzi tylko na poziomie transkrypcji czy też potranskrypcyjnie. Stabilność transkryptów fototropin badano w 10 dniowych siewkach Arabidopsis thaliana dzikiego typu ekotypu Columbia naświetlanych światłem czerwonym lub niebieskim, bądź pozostawionych w ciemności. Hodowle prowadzono na pożywce płynnej z wytrząsaniem. Przed naświetlaniem część roślin traktowano roztworem inhibitora transkrypcji – kordycepiny, a część DMSO jako kontrolę. RNA wyizolowane z zebranych siewek poddano elektroforezie, aby sprawdzić jego integralność, oraz odwrotnej transkrypcji. Uzyskane cDNA wykorzystano do przeprowadzenia reakcji PCR w czasie rzeczywistym, która pozwoliła na określenie względnej ekspresji genów fototropin. Wyniki poddano analizie statystycznej. Wykazano, że warunki świetlne wpływają na poziom PHOT1. Obserwuje się spadek tego transkryptu po naświetlaniu światłem niebieskim i czerwonym. Czas oraz obecność kordycepiny nie mają istotnego wpływu na poziom PHOT1. W przypadku PHOT2 widoczny jest niewielki wzrost ilości transkryptu pod wpływem światła. Nie wykazano jednak istotnego wpływu światła, czasu oraz obecności kordycepiny na poziom PHOT2. W przypadku transkryptów obydwu fototropin w ciemności obserwuje się wyższy poziom mRNA w roślinach infiltrowanych roztworem kordycepiny w porównaniu do próbek z roślin kontrolnych. Wynik ten wskazuje, iż związek ten może zapobiegać transkrypcji bezpośrednio lub pośrednio. W świetle niebieskim poziom PHOT2 w obecności inhibitora jest istotnie niższy niż przy jego braku, co sugeruje, że kordycepina wpływa na poziom tego tran skryptu ale w różny sposób w ciemności i na świetle. Do degradacji transkryptów zachodzi w krótkim czasie po traktowaniu roślin światłem. Uzyskane wyniki wskazują, iż światło może wpływać na stabilność transkryptów fototropin lecz nie są wystarczające, aby potwierdzić czy wykluczyć postawioną hipotezę.
Phototropins (phot) are UV-A/blue light plant photoreceptors. They enable plants to adapt to changing environmental conditions as they control rapid growth responses and intracellular movements. Two phototropins have been found in the genome of Arabidopsis thaliana: PHOT1 and PHOT2. These proteins are localized to the plasma membrane. At the N-terminus phototropins contain two LOV domains, regulated by light, oxygen or voltage, which bind flavin mononucleotides (FMN). A serine-threonine kinase domain is at the C- terminus. The functions of phototropins overlap significantly. Both photoreceptors control phototropism, stomatal opening, chloroplast accumulation, cotyledon and leaf expansion and leaf positioning. Phot1 regulates hypocotyl growth inhibition and it is responsible for the destabilization of transcripts in response to high-intensity light. Chloroplasts avoidance, their dark positioning and nuclear movement in response to high-intensity blue light are mediated only by phot2. Light, besides controlling the kinase activity of phototropins, modulates their expression at mRNA and protein levels. In irradiated plants the level of PHOT1 mRNA decreases, while the level of PHOT2 mRNA increases. The regulation of phototropin expression by light in higher plants is controlled by nuclear photoreceptors: phytochromes and cryptochromes. The goal of the research is to analyze the stability of PHOT1 and PHOT2 transcripts upon irradiation and in darkness using Arabidopsis thaliana as a model plant. The objective is to confirm or disprove the effect of light on phototropin mRNA stabilities using a transcription inhibitor – cordycepin. This experiment will help to clarify the mechanism of phototropin expression regulation, whether it is transcriptional or also post-transcriptional. The stability of phototropin transcripts was examined in 10-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana wild type, ecotype Columbia, irradiated with red light or blue light or kept in darkness. Plants were grown in a liquid medium with shaking. Before irradiation, a part of plants was treated with a solution of the transcription inhibitor – cordycepin. The rest of plants was left in DMSO as a control. RNA isolated from seedlings was separated electrophoretically, to check its integrity, and reverse transcribed. The obtained cDNA was used for real – time PCR to determine the relative expression of phototropin transcripts. The results were analyzed statistically. The results show that light conditions affect the level of PHOT1, as its transcript is reduced after blue and red light exposure. Time and the presence of cordycepin do not affect substantially the level of PHOT1. In the case of PHOT2, a slight increase in the amount of its transcript is observed after light treatment. The impact of light, time and the presence of cordycepin on the level of PHOT2 is not significant. In the case of both of phototropins, in darkness, a higher level of mRNA is observed in plants treated with cordycepin than in the control. This result suggest that the transcription inhibitor prevents transcription directly or indirectly. After blue light treatment the level of PHOT2 in the presence of the inhibitor is significantly lower than without it. This implicates that cordycepin affects the level of this transcript, but in a different way in darkness and light. Transcripts degrade shortly after light treatment. The results indicate that light can affect the stability of phototropin transcripts, but they cannot confirm or disprove this hypothesis.
