Investigation of autophagy process in CHP-134 neuroblastoma cells treated with BEZ-235 inhibitor

Neuroblastoma is a cancer of neuroectodermal origin, which is one of the most common solid tumor of childhood, located outside the central nervous system. In cancer cells PI3K/Akt/mTOR signaling pathway is often excessively activated which leads to tumor growth. Therefore, the influence of a dual inhibitor of mTOR and PI3K kinases - BEZ235 was investigated on neuroblastoma cell survival. The next aim of the study was to demonstrate an induction of autophagy process in CHP-134 neuroblastoma cells treated with BEZ-235 inhibitor. In order to measure the induction of the process, autophagic flux was assessed by using lysosomotropic agent – chloroquine. Western blot analyses were performed to measure levels of autophagy markers i.e. LC3A/B and p62 proteins. Next, expression levels of LC3B, Atg5 and beclin-1 genes were determined by Real Time PCR. Subsequently, viability tests (mesuring ATP contents) were conducted to examine the role of autophagy in neuroblastoma cell survival. These studies allowed to conclude that dual inhibitor of mTOR and PI3K kinases leads to induction of autophagy process that may act as a survival mechanism in CHP-134 neuroblastoma cells. Therefore, it is advised to apply BEZ-235 inhibitor in combination with agents that inhibit autophagy process i.e. chloroquine in future anticancer therapies.

Neuroblastoma to nowotwór złośliwy pochodzenia neuroektodermalnego, który należy do najczęstszych dziecięcych guzów litych zlokalizowanych poza ośrodkowym układem nerwowym. W komórkach nowotworowych często występującym zjawiskiem jest nadmierna aktywacja ścieżki sygnalizacyjnej PI3K/Akt/mTOR prowadząca do rozwoju guzów, dlatego też zbadano jak inhibitor kinaz mTOR oraz PI3K- BEZ-235 wpływa na przeżycie komórek neuroblastoma. Kolejno próbowano dowieść czy w badanych komórkach linii CHP-134 dochodzi do indukcji procesu autofagii pod wpływem inhibitora BEZ-235. Zastosowano środek lizosomotropowy - chlorokinę, by ustalić czy dochodzi do faktycznej indukcji badanego procesu czyli tzw. autofagic flux. Za pomocą metody western blot zbadano poziom markerów autofagii tj. białka LC3A/B oraz p62. Przeprowadzono również analizę Real Time PCR w celu zbadania poziomu transkryptów genów: LC3, Atg5 oraz bekliny-1. By sprawdzić czy autofagia umożliwia komórkom neuroblastoma przeżycie czy prowadzi do ich śmierci wykonano test żywotności - pomiar zawartości ATP w badanych komórkach. Po przeprowadzonych badaniach można wstępnie wnioskować, iż inhibitor kinazy mTOR i PI3K – BEZ-235 indukuje w komórkach neuroblastoma linii CHP-134 proces autofagii jako mechanizm umożliwiający przeżycie komórek nowotworowych. Dlatego też w celu przyszłego potencjalnego zastosowania badanego inhibitora w terapii przeciwnowotworowej należałoby stosować go w połączeniu ze związkiem hamującym autofagię np. chlorokiną.