The role of G-protein coupled membrane estrogen receptor (GPER) in mouse Leydig cell function

Estrogens are steroid hormones which play an important role in development and function of the male reproductive system. Estrogens are synthesized from conversion of androgens in the process of steroidogenesis, which takes place in Leydig cells. This process is catalyzed by cytochrome P450 aromatase enzyme complex. Estrogens exert a biological effect through the canonical estrogen receptors and also by the G-protein coupled membrane estrogen receptor. The GPER is expressed in somatic Leydig cells and Sertoli cells as well as in germ cells. Activation of the GPER receptor in the response to estrogen activates fast, non-genomic pathways of signaling transduction. GPER can interact with estrogen receptors as well as it exerts independent biological effects. In this study, the roles of the GPER in Leydig cells has been investigated in male mice at different age. Immature, mature and aged mice were treated with the antagonist GPER (G-15). The collected testicular tissues were subjected to biochemical and molecular analysis in order to investigate changes occurring after blocking GPER. To confirm the blockage of expression of GPER mRNA, real- time qRT-PCR technique was used. Moreover, histological analysis of the testes and the morphological analysis of Leydig cells were performed. Immunohistochemical staining was used to examine the changes in localization and immunoexpression of estrogen receptors (ERα and ERβ) and cytochrome P450 aromatase in Leydig cells. Additionally, by the transmission electron microscope the changes in the ultrastructure of GPER-blocked Leydig cells were analyzed. The present study revealed decreased expression of GPER mRNA after treatment with GPER antagonist. Histological staining showed that G-15 treatment resulted in hypertrophy of the interstitial tissue in mature and aging mice. Immunohistochemical analysis showed changes in the immunoexpression of ERα and ERβ as well as in the aromatase in Leydig cells of mice of different ages treated with the G-15 when compared to control groups. The pharmacological blockage of the GPER resulted in changes of Leydig cell ultrastructure. Increased number of mitochondria, lipid droplets and endoplasmic reticulum in Leydig cells of male mice treated with G-15 that were found, suggests changes in the hormonal status and cytoskeleton structure modifications of Leydig cells. The results indicate that there is intracellular interaction in the estrogen signaling pathway and that GPER signaling that modulate differently function of Leydig cells in various male age.

Estrogeny są hormonami steroidowymi, które odgrywają ważną rolę w rozwoju i funkcjonowaniu męskiego układu rozrodczego. Powstają poprzez konwersję androgenów w procesie steroidogenezy zachodzącym w komórkach Leydiga. Proces ten jest katalizowany przez kompleks enzymatyczny aromatazy (P450 arom). Estrogeny wywierają efekt biologiczny przez klasyczne receptory estrogenowe (ER, ang. estrogen receptors) oraz przez nieklasyczny błonowy receptor estrogenowy związany z białkiem G (GPER, ang. G-coupled protein estrogen receptor). Receptor GPER wykazuje ekspresję zarówno w komórkach somatycznych Leydiga i Sertoliego jak i w komórkach germinalnych. Aktywacja receptora GPER w odpowiedzi na estrogeny uruchamia szybkie, niegenowe szlaki przekazywania sygnału. Badania wykazały, że receptor GPER może zarówno współdziałać z klasycznymi receptorami estrogenowymi jak i wywierać niezależny od nich efekt biologiczny.W niniejszej pracy zbadano rolę receptora GPER w komórkach Leydiga samców myszy w różnym wieku. Myszy niedojrzałe płciowo, dojrzałe płciowo oraz starzejące się traktowano antagonistą receptora GPER (G-15). Pobrane tkanki jąder poddano analizie biochemicznej i molekularnej w celu zbadania zmian zachodzących po zablokowaniu receptora GPER u samców myszy w różnym wieku. W celu potwierdzenia wyciszenia ekspresji GPER mRNA użyto techniki qRT-PCR w czasie rzeczywistym. Przeprowadzono analizę histologiczną jąder oraz analizę morfologiczną komórek Leydiga. Za pomocą barwienia immunohistochemicznego zbadano zmiany immunoekspresji klasycznych receptorów estrogenowych (ERα i ERβ) oraz cytochromu P450 aromatazy w komórkach Leydiga. Dodatkowo, za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM, ang. transmission electron microscope) analizowano zmiany zachodzące w ultrastrukturze komórek Leydiga.Wyniki przeprowadzonych badań wykazały spadek ekspresji GPER mRNA w jądrach myszy traktowanych antagonistą receptora GPER. Barwienie histologiczne wykazało, że traktowanie G-15 spowodowało przerost tkanki interstycjalnej u myszy dojrzałych płciowo oraz starzejących się. Analiza immunohistochemiczna wykazała zmiany w immunoekspresji receptorów estrogenowych (ERα i ERβ) oraz cytochromu P450 aromatazy u osobników w różnym wieku traktowanych G-15 w porówaniu do osobników z grup kontrolnych. Farmakologiczne zablokowanie receptora GPER spowodowało zmiany w ultrastrukturze komórek Leydiga. Zwiększona ilość mitochondriów, kropel lipidowych i retikulum endoplazmatycznego w komórkach Leydiga samców traktowanych G-15 sugeruje zmiany zachodzące w gospodarce hormonalnej i cytoszkielecie komórek. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że zachodzi interakcja wewnątrzkomórkowa w szlaku sygnalizacji estrogenowej oraz że receptor GPER moduluje funkcje komórek Leydiga.