Human tissue kallikreins (KLK) are a family of proteases consisting of 15 closely related, secreted serine peptidases with trypsyn- or chymotrypsin-like specificity. Due to their proteolytic activity, kallikreins regulate many necessary processes for the proper functioning of the entire human body such as migration or cell proliferation. However, the activity of some kallikreins is associated with numerous pathological conditions, such as rosacea, Netherton's syndrome, psoriasis, pruritus or atopic dermatitis; which affect skin, the first protective barrier of our body. In the context of the aforementioned diseases, characterized by the development the skin inflammation, the role of KLK8, 13 and 14 is still unknown.The main aim of this study was to understand the role of kallikrein 8, 13 and 14 in the development of skin inflammation, by verifying the effect of kallikrein on proinflammatory cytokines production at the level of transcript and protein, as well as an attempt to identify the mechanism of action of these proteases in two types of cell lines, derived from the cells that occur in the skin. A human monocyte line (U937), further differentiated into macrophages using PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) a human keratinocyte (HaCaT) Line were used In the experiments.The results presented in this thesis, indicate the potential role of the tested kallikrein to stimulate the production of proinflammatory cytokines, such as TNFα, IL-6 and IL-8 from macrophage cells. The activity of these proteases induced a similar level of production of the above cytokines, which may be caused by employing similar activation mechanisms based on the activation of PAR-1 and PAR-4 receptors. In addition, the production of TNFα was found to be dependent on the metalloprotease activity, as indicated by the inhibitor studies. In the case of keratinocytes, for which the production of IL-6, IL-8 and IL-1β was investigated, the differences in the activity of the tested kallikreins was observed. KLK8 demonstrated the highest potential to stimulate the production of IL-6 and IL-8, while the highest level of IL-1β was observed after stimulation of the cells by KLK13. KLK14 was able to induce only IL-6 secretion. Differences between individual proteases were also visible at the level of cell activation. The low potential of KLK14 for the induction of cytokines production could be attributed to the apparent lack of signal transmission via PAR-4 receptor. Interestingly, the production of IL-1β in response to KLK8 and 13 stimulation was dependent exclusively on the activation of PAR-1 and PAR-4 receptors, without the participation of MMPs.The obtained results indicate the key role of kallikrein in the stimulation of the pro-inflammatory cytokines production by macrophage and keratinocyte cells, either directly or indirectly (with participation of MMP), following the activation of PAR receptors.
Ludzkie kallikreiny tkankowe (KLK) to rodzina proteaz składająca się z 15 blisko spokrewnionych, sekrecyjnych peptydaz serynowych o swoistości podobnej do trypsyny lub chymotrypsyny. Dzięki swojej aktywności proteolitycznej kallikreiny regulują wiele niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania całego organizmu człowieka procesów, np. migrację czy proliferację komórek. Aktywność niektórych kallikrein łączona jest jednak z licznymi stanami patologicznymi, takimi jak trądzik różowaty, zespół Nethertona, łuszczyca, świąd czy atopowe zapalenie skóry; które dotykają pierwszej ochronnej bariery naszego organizmu jaką jest skóra. W kontekście wymienionych, charakteryzujących się powstawaniem stanu zapalnego skóry chorób, rola KLK8, 13 i 14 wciąż pozostaje nieznana.Celem niniejszej pracy było poznanie roli kallikreiny 8, 13 i 14 w rozwoju stanu zapalnego skóry, po przez sprawdzenie wpływu kallikrein na produkcję cytokin prozapalnych na poziomie transkryptu jak i białka, podjęto również próbę identyfikacji mechanizmu działania tych proteaz, w dwóch rodzajach linii komórkowych, wyprowadzonych z komórek jakie występują w skórze. W doświadczeniach wykorzystano linię ludzkich monocytów (U937) zróżnicowaną do makrofagów z wykorzystaniem PMA (ang. Phorbol 12-myristate 13-acetate) jako przykład komórek układu odporności, a także linię ludzkich keratynocytów (HaCaT). Przedstawione w niniejszej pracy magisterskiej wyniki, wskazują na potencjał badanych kallikrein do stymulacji produkcji cytokin prozapalnych, takich jak TNFα, IL-6 i IL-8 z komórek makrofagów. Aktywność tych proteaz indukowała podobny poziom produkcji powyższych cytokin, co może być spowodowane wykorzystaniem przez te kallikreiny, tych samych mechanizmów, opierających się na aktywacji receptorów PAR-1 i PAR-4 oraz w przypadku produkcji TNFα również metaloproteaz macierzy zewnątrzkomórkowej - MMP. W przypadku keratynocytów, dla których zbadano produkcję IL-6, IL-8 i IL-1β, zaobserwowano różnice w działaniu badanych kallikrein. Najwyższy potencjał do stymulacji produkcji IL-6 i IL-8 wykazywała KLK8, z kolei najwyższy poziom IL-1β zaobserwowano po stymulacji komórek KLK13. KLK14 była jedynie zdolna do indukcji sekrecji IL-6. Różnice pomiędzy poszczególnymi proteazami były widoczne również na poziomie wykorzystywanych przez nie mechanizmów aktywacji komórek. Niski potencjał KLK14 do indukcji produkcji badanych cytokin mógł być spowodowany brakiem wykorzystania ścieżki sygnału zależnej od aktywacji receptora PAR-4. Co ciekawe, produkcja IL-1β w przypadku stymulacji KLK8 i 13 była zależna wyłącznie od aktywacji receptorów PAR-1 i PAR-4, bez udziału MMP.Otrzymane wyniki wskazują na istotną rolę kallikrein w stymulacji produkcji cytokin prozapalnych przez komórki makrofagów i keratynocytów po przez bezpośrednią lub pośrednią (z udziałem MMP) aktywację receptorów typu PAR.
