Spektroskopowa charakterystyka wpływu mutacji na kieszeń wiążącą β-laktoglobuliny

β-Lactoglobulin is a member of the lipocalin protein family. The function of lipocalins is to bind lipophilic ligands inside a binding pocket, formed from a twisted and coiled β-sheet. The entrance to the pocket is surrounded by loops, one of which prevents the access to the binding site in low pH (around 7 and below). Understanding the binding mechanism of ligands to lipocalins can be facilitated by amino acid substitutions inside the binding pocket (without changing their hydrophobic character) and observation of the influence of mutations on the binding.The influence of mutations on the Blg’s binding pocket was explored with the use of induced circular dichroism method. Two ligands were exploited as probes: bilirubin and retinoic acid. Titration of different Blg variants with bilirubin could help the evaluation of the influence of mutations on the region of the entrance to the binding pocket. It was shown that one Blg particle can bind more than one bilirubin particle and that mutations lead to the preferential binding of different bilirubin conformers. The inside of the pocket was examined with retinoic acid. Differences in the shapes of the CD spectra and in the amplitudes after the first addition of the probe were observed. The association constant, determined on the basis of the amplitude change at the minimum during the titration, was the highest for the WT variant and the lowest for I56F and V92F variants.The other part of research focused on the influence of mutations in positions 39 and 58 on the binding of pramoxine to Blg. The ITC experiments showed that at the pH value of 7,5 each of the mutations leads to a severalfold increase in the binding constant, compared to the WT variant. The introduction of both mutations increases the binding constant more than tenfold. For the L39Y and L39YL58F variants no influence of the pH in the 6,5-7,5 range on the binding constant was observed. The evaluation of the contribution of proton linkage to the binding enthalpy lead to the conclusion that the influence of ionic interactions on the affinity of pramoxine to the examined Blg variants is not significant. The observed existence or lack of influence of pramoxine binding on the proteins’ CD spectra in near-UV indicates different binding mechanisms for L39Y and L58F variants. In the case of L39YL58F variant, both mechanism can probably cooperate.

β-laktoglobulina jest białkiem należącym do rodziny lipokalin. Funkcją białek z tej rodziny jest wiązanie ligandów lipofilowych wewnątrz kieszeni wiążącej, utworzonej ze zwiniętego arkusza β. Wejście do kieszeni otaczają pętle, z których jedna w niskim pH (około 7 i poniżej) uniemożliwia dostęp do miejsca wiązania. W zrozumieniu mechanizmu wiązania ligandów przez lipokaliny może pomóc podmiana reszt aminokwasowych wewnątrz kieszeni wiążącej (z zachowaniem ich hydrofobowego charakteru) i obserwacja wpływu mutacji na wiązanie ligandów.W celu poznania wpływu mutacji na kieszeń wiążącą Blg zastosowano metodę indukowanego dichroizmu kołowego z wykorzystaniem dwóch ligandów: bilirubiny i kwasu retinowego. Miareczkowanie różnych wariantów Blg bilirubiną miało pozwolić na ocenę wpływu mutacji na rejon wejścia do kieszeni wiążącej. Wykazano, że możliwe jest wiązanie więcej niż jednej cząsteczki bilirubiny przez cząsteczkę Blg oraz że mutacje prowadzą do preferencyjnego wiązania bilirubiny w różnych konformacjach. Wnętrze kieszeni wiążącej było badane z wykorzystaniem kwasu retinowego. Zaobserwowano różnice w kształcie widm CD i amplitudzie po pierwszym dodatku sondy. Stała asocjacji wyznaczona na podstawie zmiany sygnału w minimum podczas miareczkowania była największa dla wariantu WT, a najmniejsza dla wariantów I56F i V92F.W drugiej części pracy badano wpływ mutacji w pozycjach 39 i 58 na wiązanie pramoksyny do Blg. Badania metodą ITC wykazały, że w pH 7,5 każda z mutacji kilkukrotnie podnosi wartość stałej asocjacji w porównaniu z wariantem WT, natomiast zastosowanie obu mutacji prowadzi do wzrostu kilkunastokrotnego. Dla wariantów L39Y oraz L39YL58F nie zaobserwowano wpływu pH w zakresie 6,5-7,5 na stałą asocjacji. Określenie wpływu wymiany protonów na entalpię wiązania doprowadziło do stwierdzenia, że wpływ oddziaływań jonowych na powinowactwo pramoksyny do badanych wariantów Blg nie jest znaczący. Obserwacja istnienia lub braku wpływu wiązania pramoksyny na widma CD białek w bliskim UV wskazuje na odmienne mechanizmy wiązania liganda przez warianty L39Y i L58F. W przypadku wariantu L39YL58F prawdopodobnie ma miejsce współdziałanie tych mechanizmów.