Analysis of the interaction of human transcription factor Yin Yang 1 with AAV P5-60 promoter element in a model system

Yin Yang 1 jest multifukcjonalnym białkiem odpowiedzialnym zarówno za aktywację, jak i represję transkrypcji w obrębie wielu promotorów komórkowych i wirusowych. Jako czynnik transkrypcyjny reguluje on procesy embriogenezy, wzrostu i różnicowania komórek oraz naprawy DNA. Zaburzenia strukturalne i funkcjonalne Yin Yang 1 stanowią podstawę wielu patologicznych procesów w komórce, m.in. kancerogenezy. Oddziaływanie YY1 z promotorem P5 wirusa AAV w obrębie rejonu P5-60 jest szeroko badanym zagadnieniem. Ze względu na brak naturalnie występującej drugiej sekwencji konsensusowej dla białka w dotychczasowych układach eksperymentalnych, postanowiono przeanalizować interakcję Yin Yang 1 z wydłużonym fragmentem promotora P5-60 AAV (P5-60ex).W ramach pracy przeprowadzono ekspresję rekombinowanego białka YY1, a następnie zweryfikowano poprawność jego struktury oraz aktywność. Wykorzystując pomiary anizotropii fluorescencji oraz test opóźnionej migracji w żelu sprawdzono zdolność wiązania się dwóch cząsteczek białka do sekwencji P5-60ex. Aby zbadać ewentualną rearanżację struktury promotora na skutek interakcji z YY1 zastosowano zjawisko FRET. Dodatkowo zweryfikowano wpływ stężenia jonów cynku na siłę wiązania białko-DNA.Wyniki doświadczeń jednoznacznie pokazują możliwość oddziaływania fragmentu P5-60ex z dwiema cząsteczkami YY1. Nie udało się jednak określić szczegółowych parametrów wiązania dla tego kompleksu. Dodatkowo, wiązanie Yin Yang 1 nie prowadzi do zagięcia P5-60ex. Zaobserwowano, że siła wiązania białka do DNA zależy od stężenia jonów Zn2+, co może mieć związek z tendencją do dimeryzacji YY1 i wpływać na proces kancerogenezy.

Yin Yang 1 is a multifunctional protein responsible for both transcriptional activation and repression within many cellular and viral promoters. As a transcription factor, YY1 regulates embryogenesis, cell growth and differentiation, as well as DNA repair processes. Structural and functional abnormalities of Yin Yang 1 are the basis of several pathological changes in cell including carcinogenesis.Interaction of YY1 with AAV P5-60 promoter element is a widely examined issue. Due to the lack of the second consensus sequence for the protein in experimental systems by far, we decided to analyze the interaction of Yin Yang 1 with extended fragment of P5-60 promoter element (P5-60ex).In this research, overexpression of recombinant Yin Yang 1 protein and verification of its structural and functional properties were performed. Using fluorescence anisotropy measurements and electrophoretic mobility shift assay, binding of two protein molecules with P5-60ex sequence was examined. To determine possible bending of promoter through protein assembly, the FRET phenomenon was involved. Additionally, an influence of zinc ions concentration on protein-DNA binding strength was tested.Obtained results clearly show the interaction of P5-60 promoter element with two Yin Yang 1 molecules. However, we did not manage to define detailed binding parameters of the complex. Yin Yang 1 do not bend AAV P5 promoter through interaction. It was noticed that the protein-DNA complex affinity was increased by higher concentration of free Zn2+ ions, which can be correlated with YY1 dimerization tendency and the processes of carcinogenesis.