Binding analysis of selected derivatives of His3-tag to H3T aptamer

One of the most commonly used fusion tags to purify recombinant proteins is the polyhistidyl tag. Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) is one of the most widely employed purification techniques for His-tagged proteins. This system is based on specific and reversible binding of histidyl residues to immobilized divalent metal ions. Elution conditions of protein bound to IMAC resin, i.e. the low pH, the presence of imidazole or divalent metal ions, may interfere with biological activity of the protein being purified. Therefore, a new chromatography system to purify proteins containing the polyhistidyl tag has been developed. It is based on the H3T aptamer which specifically binds three consecutive histidine residues (His3) as a ligand. The stability of the His3-tag/H3T aptamer complex is regulated by sodium ion concentration, which allows protein elution under mild buffer conditions. The aim of this study was to compare binding of selected derivatives of His-tag to the H3T aptamer.Constructed vectors coding for His3-tag derivatives, i.e. HGHGH-; HHGH-; HHGGH-; HHGGGH-; HH-; fused to N-terminus of GST were used for proteins production followed by their purification. Binding analysis of the GST protein variants to the H3T aptamer did not reveal their higher affinity in comparison to His3-GST.

Jedną z najpowszechniej stosowanych metek fuzyjnych umożliwiających oczyszczanie białek rekombinowanych jest metka polihistydylowa (His-tag). Chromatografia metalopowinowactwa (IMAC) stanowi jedną z najczęściej stosowanych technik oczyszczania białek zawierających metkę His. Metoda ta oparta jest na specyficznym i odwracalnym wiązaniu się reszt histydylowych do zimmobilizowanych na złożu jonów metali dwuwartościowych. Warunki elucji białka z metką His ze złoża IMAC tj. niskie pH, obecność imidazolu lub jonów metalu dwuwartościowego mogą prowadzić do zaburzeń aktywności biologicznej oczyszczanego białka. Dlatego też opracowany został nowy system oczyszczania białek zawierających metkę histydylową, wykorzystujący jako ligand aptamer DNA (H3T) specyficznie wiążący trzy kolejne reszty histydylowe (His3). Stabilność kompleksu His3/aptamer H3T regulowana jest obecnością jonów sodu, co umożliwia prowadzenie elucji w łagodnych warunkach buforowych. Celem niniejszej pracy była analiza wiązania wybranych pochodnych metki histydylowej do aptameru H3T.Stworzone konstrukty genetyczne kodujące pochodne metki histydylowej, tj. HGHGH-; HHGH-; HHGGH-; HHGGGH-; HH- , dołączone na N-końcu białka GST umożliwiły produkcję i oczyszczenie pożądanych białek. Analiza wiązania pochodnych metki histydylowej do aptameru H3T nie wykazała zwiększonego powinowactwa żadnej z nich w porównaniu z metką His3.