Experimental verification of a putative role of Sll0034 protein as a carboxypeptidase involved in cell wall metabolism of cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803, through generation of sll0034 gene deletion mutant

Komórka cyjanobakterii otoczona jest ścianą komórkową składającą się z zewnętrznejbłony komórkowej, warstwy peptydoglikanu i błony cytoplazmatycznej, które biorą udział w transporcie niezbędnych związków do komórki. Peptydoglikan jest zbudowany z łańcuchów N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylomuraminowego połączonych wiązaniami β-l,4-glikozydowymi oraz usieciowanych kowalencyjnie przyłączonymi oligopeptydami, w których skład wchodzą, m. in. D-alanina i kwas-D-glutaminowy. Peptydoglikan znajdujący się w ścianie komórkowej sinic tworzy znacznie grubszą warstwę i jest znacznie bardziej usieciowany niż u innych bakterii gram ujemnych.Niewiele wiadomo na temat enzymów uczestniczących w metabolizmie ściany komórkowej sinic. DD-karboksypeptydazy uważane są za enzymy biorące udział w procesie wydłużania peptydoglikanu i tworzeniu septy. Podejrzewa się, że białka Sll0777 i Sll0034 biorą udział w dojrzewaniu i metabolizmie peptydoglikanu w komórkach Synechocystissp. PCC6803. U wielu organizmów prokariotycznych występują geny o dużym podobieństwie do genu sll0777, jednak geny wykazujące znaczne podobieństwo do genu sll0034 występują tylko u sinic.Celem pracy było wytworzenie i wstępna charakterystyka sinic pozbawionych enzymów Sll0034 lub Sll0777 w celu zbadania ich roli fizjologicznej.Metodą klonowania bezszwowego przygotowano konstrukty do transformacji sinic, w których zamiast genów sll0034 i sll0777 wstawiono geny oporności na antybiotyki. Tak przygotowanym wektorem transformowano sinice. Sinice są naturalnie kompetentne, zdolne do pobrania materiału genetycznego z otoczenia i włączenia go do genomu na zasadzie rekombinacji homologicznej. Segregację transformantów prowadzono na podłożu selekcyjnym z dodatkiem antybiotyku. Po czterokrotnym pasażowaniu transformantów przeprowadzono test oporności na antybiotyki działające na ścianę komórkową: karbenicylinę, polimyksynę B i kolistynę. Wytworzony szczep z delecją genu sll0034 okazał się znacznie bardziej wrażliwy na działanie karbenicyliny niż szczep typu dzikiego.Wytworzony mutant sll0034- będzie stanowił podstawę do kontynuacji badań nad szczegółową charakterystyką białka Sll0034 i jego roli w komórkach sinic.

Cyanobacterial cell is surrounded by a cell wall consisting an outer cell membrane, peptidoglycan layer and cytoplasmic membrane. Peptidoglycan is composed of chains of N-acetylglucosamine and N-acetylmuramic acid linked by β-1,4-glycosidic bonds and covalently linked oligopeptides, including D-alanine and D-glutamic acid. The peptidoglycan of cyanobacterial cell wall forms thicker layer and is more crosslinked than the ones from other types of gram-negative bacteria.Little is known about enzymes involved in cyanobacterial cell wall metabolism. DD-carboxypeptidases are predicted to be involved in peptidoglycan elongation. Sll0777 and Sll0034 proteins are suspected to be engaged in peptidoglycan metabolism in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. Genes with high similarity to the sll0777 geneare found innumerous prokaryotic organisms, while genes showing significant resemblance to the sll0034 gene are found only in cyanobacteria.The aim of this work was to construct deletion strains sll0034- and sll0777- of Synechocystis sp. PCC6803, in order to verify involvement of Sll0034 and Sll0777 proteins in cell wall physiology.Seamless cloning method was employed to prepare transformation vectors, in which genes of interest were replaced with antibiotic resistance genes. Cyanobacteriaare naturally competent organisms able to uptake genetic material and incorporate it into the genome via homologous recombination process. Transformants were segregated on a selective medium supplemented with proper antibiotic. After four passages antibiotic resistance test was conducted. The new sll0034- strain exhibited significantly increased sensitivity to carbenicillin, as compared to the wild type. The new mutant strain sll0034-generated in this work will be further characterized in the future projects aiming at detailed elucidation of physiological role of Sll0034 protein.