Modyfikacja genetyczna bakterii Salmonella Typhimurium szczepów LT2 oraz VNP20009 za pomocą konstruktu pD881+sbvB w celu zwiększenia ich potencjału terapeutycznego

Już pod koniec XIX wieku wykorzystywano bakterie w celach leczenia nowotworów, a współcześnie za jedną z obiecujących opcji uważany jest modyfikowany genetycznie szczep Salmonella Typhimurium VNP20009. Białko SpvB (ang. Salmonella virulence plasmid protein B) jest kodowane przez gen spvB występujący u wielu szczepów bakterii z rodzaju Salmonella. Białko to jest zdolne do ADP-rybozylacji aktyny komórek eukariotycznych, zakłócania jej polimeryzacji oraz w efekcie do powodowania ich śmierci w wyniku apoptozy.Celem pracy było otrzymanie konstruktu pD881+spvB, sklonowanie go w bakteriach Escherichia coli TOP10 oraz transformacja szczepów LT2 i VNP20009 Salmonella Typhimurium uzyskanym plazmidem.Klonowanie przeprowadzono klasyczną metodą z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych NdeI i NotI-HF oraz ligazy DNA. Wstawkę spvB uzyskano dzięki zastosowaniu reakcji PCR. Po transformacji kompetentnych bakterii E. coli TOP10 konstruktem pD881+spvB przeprowadzono analizę klonów metodą PCR. W celu potwierdzenia obecności konstruktu w otrzymanych klonach oraz poprawnej orientacji wstawki w plazmidzie wykonano analizę restrykcyjną. Ostatnim etapem była elektrotransformacja kompetentnych szczepów LT2 i VNP20009 Salmonella Typhimurium prawidłowym konstruktem pD881+spvB.Wyniki tej pracy ukazały, że uzyskano nowe warianty genetyczne bakterii Salmonella Typhimurium szczepów LT2 oraz VNP20009 zawierające konstrukt pD881+spvB.

By the end of the 19th century, bacteria were used to treat cancer and nowadays genetically modified Salmonella Typhimurium VNP20009 is considered as one of the promising options. The SpvB protein (Salmonella virulence plasmid protein B) is encoded by the spvB gene found in many strains of Salmonella. This protein is capable of ADP-ribosylation of eukaryotic cell actin, interfering with its polymerization and, as a result, leading to cell death due to apoptosis.The aim of the work was to obtain the construct pD881+spvB, to clone it in Escherichia coli TOP10 and to transform Salmonella Typhimurium strains LT2 and VNP20009 with this plasmid.Cloning was performed by the classical method using NdeI and NotI-HF restriction enzymes and DNA ligase. The spvB insert was obtained with PCR. After transformation of the competent E. coli TOP10 bacteria, the pD881+spvB construct was subjected to colony PCR. In order to confirm the presence of the construct in the obtained clones and the correct orientation of the insert in the plasmid, a restriction analysis was performed. The last stage was electrotransformation of competent Salmonella Typhimurium LT2 and VNP20009 strains with the correct pD881+spvB construct.The results of this study showed that new genetic variants of the Salmonella Typhimurium bacteria strains LT2 and VNP20009 were obtained containing the pD881+spvB construct.