Gromadzenie białka XRCC1 przy indukowanych pęknięciach pojedynczej nici DNA wywoływanych światłem widzialnym

mCherry jest białkiem fluorescencyjnym, często stosowanym jako marker molekularny. XRCC1 jest ważnym białkiem pełniącym rolę przy naprawie DNA, składa się z 3 domen, a każda pełni ściśle określone funkcje. Oddziałuje ono z innymi białkami jądrowymi tworząc skomplikowane kompleksy naprawcze przy SSBR. Przeprowadzono transfekcję komórek eukariotycznych z linii U2-OS plazmidem zawierającym białko fuzyjne 3×mCherry-XRCC1. Eksperyment polegał na przedstawieniu różnic pomiędzy białkiem GFP a mCherry przy uzyskiwaniu obrazu mikroskopowego na podstawie obserwacji sygnału pochodzącego od XRCC1 wzbudzonego światłem lasera oświetlającego jądro komórki przez 1, 4 oraz dwukrotnie przez 8 sekund, a następnie obserwacji XRCC1 w czasie po oświetlaniu laserem. Zweryfikowano płaszczyznę zrobionych fotografii wykonując dodatkową serię zdjęć będących trójwymiarową reprezentacją jądra komórkowego z odległością pomiędzy poszczególnymi zdjęciami wynoszącą 130nm. Do obrazowania oraz analizy obrazu posłużono się programami Leica Las AF oraz ImageJ. Obserwacja sygnału po 1, 4 i 8 sekundach oświetlania jądra komórkowego laserem pokazuje podobny sygnał do tego w przypadku białka GFP. Widoczne w badanym ROI widoczne są specyficzne ogniska, tym większe im dłuższy był czas działania światła lasera. Intensywność sygnału pochodząca od XRCC1 spada w czasie, co jest również wynikiem przewidywalnym i zgodnym z oczekiwaniami.

The mCherry is a fluorescent protein, often used as molecular marker. XRCC1 is an important protein that plays main role in DNA repair. It consists of three domains, each with strictly defined functions. It interacts with other nuclear proteins creating large repair complexes at SSBR. Transfection of eukaryotic cells from the U2-OS line was performed with a plasmid containing the 3×mCherry-XRCC1 fusion protein. The experiment consisted of demonstrating the differences between the GFP protein and mCherry in obtaining microscopic image based on the signal observation of excited XRCC1 inducted by laser light for 1, 4 and twice for 8 seconds, and next XRCC1 observation in time after laser exposure. The plane of photographs taken was verified by making an additional series of photographs that are a three-dimensional representation of the nucleus with a distance between individual photographs of 130 nm. The Las AF and ImageJ are programs, which were used for imaging and image analysis. Observation of the signal after 1, 4 and 8 seconds of illumination of the cell nucleus with a laser shows a similar signal to that of the GFP protein. The specific focuses visible in the tested ROI are visible, the greater the longer the duration of the laser light. The signal intensity from XRCC1 drops over time, which is also predictable and consistent with expectations.