Studies of azidoalkylmaleimide derivatives as tools for the functionalisation of sulfur-containing aminoacids

In aminoacids, the thiol (-SH) group is a fragment that performs important physiological and structural functions, and provides a convenient place for protein functionalisation.The aim of the work was to obtain azidoalkylmaleimide derivatives and investigate their use for sulfur-containing aminoacid and peptide functionalisation through the thia-Michael reaction. Glutathione (GSH) was chosen as the model peptide. It is easily accessible, allows to mimic cysteine behavior in the peptide chain and understand aspects concerning protein polarity and solubility. Moreover, GSH has important physiological functions. It participates in cells’ oxidation-reduction processes and protects against oxidative stress. GSH modifications can find many applications, and chromophore reagent derivatisation is a basic quantification method for this peptide.Within this work, eight new compounds were obtained, undescribed in previous literature. These primarily include two N-(pentyl)maleimide derivatives that have been used for GSH functionalisation studies and azo dye propargyl ethers. GSH functionalization with the newly synthesized N-(azidopentyl)maleimide, revealed that depending on the pH, various products may form, including disubstituted glutathione derivatives. Further research enabled to indicate the conditions allowing to obtain mono- or disubstituted GSH derivatives and assess the difficulties in the synthesis and purification of these compounds.The use of 1,2,3-triazole N-(azidopentyl)maleimide conjugate with Sudan I dye propargyl ether allowed to determine GSH concentration by HPLC with UV detection. A calibration curve was prepared with 183 μmol/l quantification limit (LOQ) and 54.9 μmol/l detection limit (LOD). The GSH level was successfully determined for a 400 μmol/l sample and estimated for a 162.8 μmol/l sample.

Grupa tiolowa (-SH) w strukturze aminokwasów jest fragmentem pełniącym istotne funkcje fizjologiczne i strukturalne, a dodatkowo stanowi wygodne miejsce funkcjonalizacji białek.Celem pracy było otrzymanie związków zawierających fragment azydoalkilomaleimidowy oraz przebadanie ich wykorzystania do funkcjonalizacji aminokwasów i peptydów zawierających siarkę w reakcji tia-Michaela. Jako modelowy peptyd wybrano glutation (GSH). Jest on łatwo dostępny i pozwala na przybliżenie zachowania cysteiny w łańcuchu peptydowym oraz poznanie aspektów związanych z polarnością i rozpuszczalnością białek. Ponadto GSH pełni istotną funkcję fizjologiczną, uczestnicząc w procesach oksydacyjno-redukcyjnych komórek, chroni przed stresem oksydacyjnym. Modyfikacje GSH mogą znaleźć wiele zastosowań, a derywatyzacja za pomocą odczynników chromoforowych jest jedną z podstawowych metod oznaczania tego peptydu.W ramach pracy otrzymano osiem nowych związków, nie opisanych w literaturze. Należą do nich przede wszystkim dwie pochodne N-(pentylo)maleimidu, które zostały wykorzystane do badań nad funkcjonalizacją GSH oraz etery propargilowe barwników azowych. Podczas funkcjonalizacji GSH za pomocą nowo zsyntezowanego N-(azydopentylo)maleimidu odkryto, że w reakcji tej, zależnie od pH, mogą powstawać różne produkty, w tym dwupodstawiona pochodna glutationu. Dzięki przeprowadzonym badaniom udało się wskazać warunki pozwalające na otrzymanie jedno- lub dwupodstawionych pochodnych GSH oraz ocenić trudności w syntezie i oczyszczaniu tego typu związków.Wykorzystanie 1,2,3-triazolowego koniugatu N-(azydopentylo)maleimidu z eterem propargilowym barwnika Sudan I umożliwiło oznaczenie stężenia GSH metodą HPLC z detekcją UV. Sporządzono krzywą kalibracyjną, dla której granica oznaczalności (LOQ) wyniosła 183 µmol/l, natomiast granica wykrywalności (LOD) 54,9 µmol/l. Oznaczono poziom GSH dla próbki o stężeniu 400 µmol/l oraz oszacowano dla próbki o stężeniu 162,8 µmol/l.