Analiza lektynowa glikozylacji białek osocza chorych z rakiem endometrium. Próba oceny glikozylacji ludzkiej irisiny

Glycosylation of proteins is one of the most common posttranslational modifications affecting of many biological processes. Altered N-glycosylation is considered as a universal feature of cancer cells. Changes in glycan structure play an important role during the initiation and progression of cancer and metastasis. The most common type of malignant tumor of female reproductive organs is endometrial cancer. In many types of cancer, changes in the N-glycosylation of plasma proteins, including immunoglobulin G (IgG), which is the major glycoprotein found in the human circulation, are observed. The IgG Fc region has a highly conserved N-glycosylation site. IgG glycans modulate antibody effector functions, and changes in their sugar composition may inhibit or stimulate an immune response. Irisin, a newly discovered adipomiokine released into circulation as a result of the proteolytic cleavage of FNDC5 membrane protein, also belongs to plasma proteins. The irisin secretion is regulated by two N-glycans present on its surface. Many studies have confirmed the pleiotropic effect of irisin. The beneficial effects of this molecule include modulation of metabolic processes, reduction of systemic inflammation, maintenance of balance between resorption and bone formation. Irisin is also involved in the cancerogenesis. Changes in the structure of N-glycans in endometrial cancer have been studied to a limited extent so far. The structure of irisin N-glycans is also unknown. The aim of the study was a comparative analysis of plasma N-glycosylation in endometrial cancer patients and healthy donors. Moreover, the initial characterization of the irisin N-glycans and an attempt to assess possible changes in the glycosylation of this protein in endometrial cancer were planned. The analysis was performed using the lectin-probed western blot with AAL, UEA I, SNA, MAL II, GNA and PHA-E lectins. Irisin was identified by immunodetection using anti-FNDC5 and mass spectrometry (MS). The obtained results indicate a tendency to N-glycosylation changes of plasma proteins including IgG in endometrial cancer, but the differences that were found are not statistically significant for the analyzed number of samples (n = 16). The result obtained by MS indicates the non-specificity of the used anti-FNDC5 antibodies and a series of cross reactions with other human plasma proteins. As a result, the glycosylation profiles of plasma proteins in the mass range of 15–35 kDa relate not to irisin but to other plasma glycoproteins, among which the highest scoring match of peptides showed ficolin-3 and apolipoprotein D. Preliminary results are a prerequisite for continuing research in the searching for sugar markers in plasma of patients with endometrial cancer.

Glikozylacja białek jest jedną z najbardziej powszechnych potranslacyjnych modyfikacji, wpływających na przebieg wielu procesów biologicznych. Zaburzenia N-glikozylacji są obecnie uznawane za uniwersalną cechę komórek nowotworowych. Odgrywają istotną rolę w trakcie inicjacji i progresji nowotworu oraz metastazie. Najczęstszym w skali światowej typem nowotworu złośliwego narządów rodnych kobiety jest rak endometrium. W wielu typach nowotworów obserwuje się zmiany N-glikozylacji białek osocza, w tym immunoglobuliny G (IgG) będącej główną glikoproteiną występującą w ludzkim krążeniu. Region Fc IgG posiada wysoce konserwatywne miejsce N-glikozylacji. Glikany IgG modulują funkcje efektorowe przeciwciał, a zmiana ich składu cukrowego może hamować lub pobudzać odpowiedź immunologiczną. Do białek występujących w osoczu należy również irisina, nowoodkryta adipomiokina uwalniana do krążenia w efekcie cięcia proteolitycznego błonowego białka FNDC5. Wydzielanie irisiny jest regulowane przez dwa N-glikany obecne na jej powierzchni. Wiele badań potwierdziło plejotropowe działanie irisiny. Korzystny wpływ tej cząsteczki obejmuje modulacje procesów metabolicznych, zmniejszenie ogólnoustrojowego stanu zapalnego, utrzymanie równowagi między resorpcją a tworzeniem kości. Jest również zaangażowana w proces nowotworzenia. Zmiany struktury N-glikanów w raku endometrium były dotychczas w niewielkim stopniu badane. Nieznana jest również budowa N-glikanów irisiny. Celem niniejszej pracy magisterskiej była analiza porównawcza N-glikozylacji białek osocza u kobiet z rakiem endometrium oraz zdrowych dawczyń, a także wstępna charakterystyka części cukrowej irisiny oraz próba oceny ewentualnych zmian glikozylacji tego białka w tym typie nowotworu. Analizę wykonano metodą lektynową wykorzystując lektyny AAL, UEA I, SNA, MAL II, GNA oraz PHA-E. Irisinę identyfikowano metodą immunodetekcji z użyciem przeciwciał anty-FNDC5, a także spektrometrią mas (MS). Badania wskazują na tendencję do zmian N-glikozylacji białek osocza, w tym IgG w raku endometrium, ale różnice, które stwierdzono nie są istotne statystycznie dla przeanalizowanej liczby próbek (n=16). Wynik uzyskany metodą MS wskazuje na niespecyficzność używanych przeciwciał anty-FNDC5 oraz szereg krzyżowych reakcji z innymi białkami występującymi w ludzkim osoczu. W efekcie profile glikozylacji białek osocza z zakresu masowego 15–35 kDa odnoszą się nie do irisiny a do innych glikoprotein osocza, spośród których największe dopasowanie peptydów wykazała fikolina-3 i apolipoproteina D. Wstępne wyniki stanowią przesłankę do kontynuacji badań w poszukiwaniu markerów cukrowych w osoczu chorych z rakiem endometrium.