Optimizing the preparation and production of the human transcription factor Yin Yang 1 for use in NMR spectroscopy

Yin Yang 1 to wielofunkcyjny czynnik transkrypcyjny, odpowiedzialny za liczne procesy o istotnym znaczeniu dla rozwoju i funkcjonowania organizmu. Białko zawiera domenę palców cynkowych oddziałującą z DNA, jak i nie mniej ważny fragment regulatorowy o nieuporządkowanej strukturze, znajdujący się na N końcu białka (NTF).W niniejszej pracy podjęto próbę uzyskania preparatów białkowych NTF znakowanych izotopowo 15N i 13C, w celu przeprowadzenia pomiarów z wykorzystaniem spektroskopii NMR, oraz wdrożono nową metodę ekspresji, pozwalającą na podwójne znakowanie izotopami, ograniczając ich zużycie. W trakcie prowadzenia badań opracowano metodę preparatyki białka po nadekspresji w medium minimalnym. Określono właściwości strukturalne oraz dynamiczne NTF w przygotowanych preparatach o wysokim stężeniu z wykorzystaniem sączenia molekularnego oraz dichroizmu kołowego, a także oznaczono stabilność uzyskanego białka. Zbadano wpływ liofilizacji i obniżonego pH na parametry strukturalne białka a także proces dimeryzacji indukowanej jonami cynku, dodatkowo określając maksymalne stężenie tychże jonów, pozwalające na obserwację procesu bez indukcji agregacji. Ponadto stworzono pięć wektorów ekspresyjnych pozwalających na ekspresję krótszych fragmentów białka. Przetestowano warunki ekspresji dla każdego z nich, natomiast dla pierwszego z konstruktów (YY1-F12) opracowano metodę oczyszczania. Ostatecznie uzyskano preparaty NTF oraz YY1-F12 znakowane zarówno 15N, jak i 15N i 13C w warunkach optymalnych do przeprowadzenia badań z wykorzystaniem NMR. Z sukcesem wyznaczono pierwsze widma BEST-TROSY dla NTF znakowanego 15N, a także zaobserwowano zmiany w uzyskanych widmach wywołanych obecnością cynku. Przeprowadzone prace i uzyskane wyniki niosą ze sobą duże nadzieje na prowadzenie dalszych badań i przybliżają do określenia przestrzennych preferencji strukturalnych nieuporządkowanego fragmentu YY1, a także wskazania regionów białka odpowiedzialnego za dimeryzację.

The Yin Yang 1 is a multifunctional transcription factor involved in numerous processes of significant importance for the development and function of the organism. The protein contains the zinc fingers domain, responsible for interaction with DNA, as well as an important regulatory disordered fragment located at the N-terminus of the protein (NTF).In this work, the attempt was made to prepare the specimens of NTF labeled with 15N and 13C isotopes, adapted to perform the NMR measurements, and implement the new overexpression method, which allows for double isotope labeling with limiting the substrates usage. During the research, the method of protein preparation after overexpression in the minimal medium was developed. The stability, structural and dynamic properties of high-concentrated, lyophilized NTFs specimens were determined using size exclusion chromatography and circular dichroism. The influence of lower pH on protein structure and the process of dimerization induced by zinc ions was investigated, as well as the maximal concentration of the ions leading to achieve dimerization without protein aggregation. In addition, five expression vectors have been designed, which all of them allow the expression of shorter protein fragments. The expression conditions for each of them were tested, while for the first of the constructs (YY1-F12) a purification method was developed.Finally, the specimens of NTF and YY1-F12 15N-labeled and 15N-13C-double-labeled were produced under optimal conditions for performing the NMR measurements. The first BEST-TROSY spectra for 15N-labelled NTF were determined. The changes in the spectra caused by zinc ions presence were also observed. Performed studies and obtained results give a hopes for further investigations and bring closer to determine the structural preferences of the disordered fragment of YY1, as well as indicating the regions of the protein responsible for dimerization.