Culture of Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum cv. Samsun transgenic plants with overexpression of AtUVR3 gene and its variants. Analysis of expression level on mRNA level and of location of AtUVR3 protein

Praca "Hodowla roślin transgenicznych Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana i Nicotiana tabacum cv. Samsun z nadekspresją AtUVR3 i jego wariantów. Badanie poziomu ekspresji na poziomie mRNA oraz lokalizacji białka AtUVR3." opierała się na hodowli roślin transgenicznych Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana i Nicotiana tabacum cv. Samsun, a jej celem było uzyskanie tych roślin z wprowadzonymi mutacjami w obrębie genu kodującego fotoliazę UVR3 z przyłączonym GFP na jednym lub drugim końcu białka. Zmodyfikowany gen znajdował się pod kontrolą silnego promotora 35S CaMV. Badano również poziom ekspresji UVR3 na poziomie mRNA w roślinach z jego nadekspresją i lokalizację w komórce wersji GFP-UVR3 w uzyskanym transgenicznym N. tabacum. Do transformacji wykorzystano metodę "floral-dip" oraz transformację krążków liściowych używając Agrobacterium tumefaciens. Promieniowanie UV powoduje powstawanie uszkodzeń w DNA, tzw. fotoproduktów. W rozdziale pierwszym przedstawiono najważniejsze zagadnienia teoretyczne na temat fotoliaz (w tym UVR3) oraz opisano mechanizm, przy pomocy którego fotoliazy usuwają tworzące się w DNA fotoprodukty. Rozdział drugi omawia cel pracy. Rozdział trzeci zawiera szczegółowe opisy metod i materiałów stosowanych w przeprowadzanych doświadczeniach, tj. w transformacji pąków kwiatowych metodą "floral-dip", badaniu poziomu ekspresji genu UVR3 na poziomie mRNA oraz w badaniu lokalizacji białka GFP-UVR3. Kolejny rozdział to prezentacja uzyskanych wyników, po których następują omówienie i wnioski. W doświadczeniach udało się uzyskać roślinę transgeniczną Arabidopsis thaliana przy pomocy transformacji "floral-dip" w przypadku jednego z mutantów, u którego białko UVR3 pozbawione było sekwencji N-końcowej. Jest to roślina heterozygotyczna. Badanie poziomu mRNA genu UVR3 u Arabidopsis thaliana typu dzikiego oraz nadekspresorach, w których użyto silny promotor, pozwoliło stwierdzić, że światło białe działa hamująco na transkrypcję tego genu. Obserwacje z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego fragmentów liści tytoniu z białkiem fuzyjnym GFP-UVR3 pokazały, że białko to lokalizuje się równomiernie na terenie jądra komórkowego, czyli w sposób odmienny niż białko fuzyjne UVR3-GFP, które wykazuje wyraźną lokalizację w jąderku.

Thesis "Culture of Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum cv. Samsun transgenic plants with overexpression of AtUVR3 gene and its variants. Analysis of expression level on mRNA level and of location of AtUVR3 protein." was based on culture of Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum cv. Samsun transgenic plants, and an objective of the thesis was obtaining these plants with introduced mutations within a gene encoding UVR3 photolyase with attached GFP at one or the other end of the protein. Modified gene was under the control of a strong promoter 35S CaMV. The expression of UVR3 in plants with overexpression this gene and a location of the protein GFP-UVR3 in obtained transgenic N. tabacum were analyzed. A "floral-dip" method and leaf disc transformation with Agrobacterium tumefaciens was used to obtain transgenic plants.UV radiation causes formation of damages in DNA called photoproducts. First chapter presents the most important theoretical issues about photolyases (including UVR3) and describes mechanism of removing of photoproducts in DNA by photolyases. Second chapter discusses the purpose of the thesis. Third chapter contains detailed description of methods and materials used in experiments, i.e. flower buds transformation with "floral-dip" method, analysis of expression level of UVR3 gene and analysis of location GFP-UVR3 protein. The next chapter presents results, followed by a discussion and conclusions. In experiments using "floral-dip" method Arabidopsis thaliana transgenic plant with an N-terminal sequence of UVR3 protein was obtained. It is a heterozygous plant. The analysis of mRNA level of UVR3 gene in Arabidopsis thaliana wild type and in overexpressors of this gene under the control of strong promoter allowed to state, that white light inhibits UVR3 transcription. Observations of leaf fragments of tobacco with GFP-UVR3 fusion protein using a confocal microscope showed, that this protein is located evenly on the area of the cell nucleus, in a different way than fusion protein UVR3-GFP, which shows clear location in nucleolus.