The purification of Pfu and Taq recombinant polymerases and the comparison their activity with the commercially available enzymes

Nowadays polymerases are very popular due to their common usage in PCR. Therefore, it is necessary to develop a method that allows to obtain thermostable enzymes in large quantities. The most commonly used polymerases are Pfu and Taq. The Pfu polymerase is a protein with a molecular weight approximately 90 kDa. It exhibits 5'→ 3' DNA polymerase activity, as well as 3'→ 5' exonuclease activity, also called ‘proofreading activity’ which is responsible for correcting erroneously introduced nucleotides. The molecular weight of Taq polymerase is approximately 94 kDa, the enzyme has 5'→ 3 'exonuclease activity but has no 3'→ 5' exonuclease activity, which is associated with relatively low replication fidelity compared to the Pfu polymerase. The aim of this experiment was to obtain recombinant Pfu and Taq polymerases based on the Rapid purification of high-activity Taq and Pfu DNA polymerase protocol, which was performed using the E. coli: BL21 pLysS and DH5ɑ strains. Subsequently, using the PCR method, the evaluation of the enzymatic activity was performed, basing on the comparison between recombinant enzymes and commercially available polymerases.

Współcześnie polimerazy zawdzięczają swoją dużą popularność dzięki ich powszechnemu zastosowaniu w technice PCR. W związku z tym konieczne jest opracowanie metody umożliwiającej pozyskanie termostabilnych enzymów w dużych ilościach. Do najczęściej wykorzystywanych polimeraz należą polimerazy Pfu oraz Taq. Polimeraza Pfu jest białkiem o masie około 90 kDa. Wykazuje aktywność polimerazy DNA 5’→ 3’, a dodatkowo aktywność egzonukleazy 3’→ 5’, która odpowiada za korektę błędnie wprowadzonych nukleotydów. Polimeraza Taq ma masę około 94 kDa, posiada aktywność egzonukleazy 5’→ 3’, ponadto nie wykazuje aktywności egzonukleazy 3’→ 5’, co wiąże się ze stosunkowo niską wiernością replikacji w porównaniu do polimerazy Pfu. Celem niniejszej pracy było otrzymanie rekombinowanych polimeraz Pfu oraz Taq na podstawie protokołu Rapid purification of high-activity Taq and Pfu DNA polymerase. Procedurę przeprowadzono z wykorzystaniem szczepów E. coli: BL21 pLysS oraz DH5ɑ. Następnie, przy pomocy techniki PCR, dokonano oceny aktywności enzymatycznej oczyszczonych enzymów na podstawie porównania ich z komercyjnie dostępnymi polimerazami.