Wpływ pola powierzchni naczynia hodowlanego na liczbę kardiomiocytów otrzymanych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są komórkami o dużym potencjale wykorzystania w medycynie regeneracyjnej, przy poszukiwaniu nowych leków czy tworzeniu modeli chorób. Otrzymane z nich kardiomiocyty (hiPSC-CM) mogą w przyszłości być pomocne w leczeniu chorób serca, przykładowo w terapii osób, które przeszły zawał serca. Aby móc wykorzystać hiPSC-CM w leczeniu ludzi, konieczna jest jednak optymalizacja zarówno metod różnicowania, jak i pozwalających na otrzymanie czystej populacji kardiomiocytów. Celem przeprowadzonych badań była analiza zależności między polem powierzchni naczynia hodowlanego, w którym przeprowadzono różnicowanie hiPSC, a ilością otrzymanych w ten sposób kardiomiocytów. Różnicowanie przeprowadzono na płytkach 6, 12 i 24 dołkowych zgodnie z protokołem opierającym się na sekwencyjnym zahamowaniu kinazy GSK3β oraz szlaku WNT za pomocą związków drobnocząsteczkowych. Selekcja metaboliczna pozwalająca na otrzymanie czystej populacji kardiomiocytów opierała się na ich zdolności wykorzystania mleczanu jako źródła energii, co odróżnia je od pozostałych typów komórek. W celu ustalenia dokładnej liczby otrzymanych z poszczególnych płytek hiPSC-CM komórki zliczano oraz oznaczano procent żywotności przy użyciu aparatu MUSE, a także przeprowadzono analizę FACS z wykorzystaniem przeciwciał rozpoznających sercowo-specyficzną troponinę T (cTnT). Uzyskane wyniki sugerują, że pole powierzchni naczynia hodowlanego może wpływać na tempo różnicowania oraz że jego zmniejszenie przyczynia się do zwiększenia liczby kardiomiocytów, którą możemy otrzymać z 1 cm2, a przez to mogą przyczynić się do dalszej optymalizacji procesu otrzymywania hiPSC-CM.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSC) demonstrate high potential for use in regenerative medicine, screening for new drugs, or creating disease models. The cardiomyocytes derived from them (hiPSC-CM) may be helpful in the future in the treatment of heart diseases, for example in the therapy of people who survived myocardial infarction. In order to fully exploit this potential, it is necessary to optimize both the hiPSC differentiation methods and methods of obtaining a pure population of hiPSC-CM. The aim of this study was to analyze the relationship between the surface area of the cell culture dish in which differentiation is performed and the yield of derived cardiomyocytes. Differentiation was performed on 6, 12 and 24 well plates according to the protocol based on small molecule-mediated inhibition of GSK3β kinase and the WNT pathway. The metabolic selection for obtaining a pure population of hiPSC-CM was based on the their ability to use lactate as a source of energy, which distinguishes them from other cell types. In order to determine the exact number of cardiomyocytes obtained from each plate, the cells were counted and the viability percentage was determined using MUSE equipment as well as the FACS analysis of cardiac troponin T (cTnT)-positive cells. The results suggest that the surface area of the culture dish may influence the rate of differentiation, and that reduction of surface area contributes to an increase in the number of cardiomyocytes that we can derived from 1 cm2. This findings may contribute to development of better methods of hiPSC-CM generation.