Projekt i charakterystyka lipidowego nanodysku zawierającego bakteriorodopsynę

Membrane proteins, despite being 30% of all known proteins, are largely uncharacterized. This is mostly due to problematic handling of them and difficult purification methods. To overcome these problems, a number of simplified biological membrane models have been invented. They enable the study of membrane proteins in a closer-to-native environment and without detergents. One of the most popular models, introduced relatively recently is the nanodisc. It is a quasi-native lipid bilayer, enclosed with two MSP proteins. Membrane proteins may be incorporated in such a system, allowing them to be studied in aqueous solutions. However, to responsibly use this model, it should also be well characterized. In this work, nanodiscs with incorporated membrane protein, bacteriorhodopsin, have been studied. Its formation has been optimized and characterized with various methods, such as Dynamic Light Scattering (DLS), Transmission Electron Microscopy (TEM) and Size Exclusion Chromatography (SEC). The effect of membrane protein incorporated in a lipid environment on the nanodisc has been evaluated using Electron Paramagnetic Resonance spectrometry (EPR). Various parameters describing the behaviour of lipids have been calculated and the results were compared with previous studies of liposomes and nanodiscs without a membrane protein incorporated. Membrane protein significantly decreased the polarity of the bilayer. Lipid movement was found to be highly anisotropic. Nevertheless, packing of lipids within the membrane did not change significantly. The acquired data will help to better understand this model system widely used in biochemistry. Hopefully, more such experiments will be performed to finally answer the question whether the nanodiscs are a reliable technology and if the data obtained with their use can be extrapolated to in vivo conditions.

Pomimo stanowienia około 30% wszystkich białek, białka błonowe są wciąż mało poznane i słabo scharakteryzowane. Praca z nimi nie należy do łatwych, a ich oczyszczanie wiążę się z szeregiem problemów. Aby pokonać te przeciwności, powstało wiele modeli błon lipidowych, uproszczonych w stosunku do naturalnych systemów. Umożliwiają one badanie białek błonowych w środowisku bardziej dla nich naturalnym i uniezależniają eksperymenty od często stosowanych detergentów. Jednym z najnowszych modeli błony jest nanodysk. Jest to quasi natywna dwuwarstwa lipidowa otoczona pierścieniami białek MSP (membrane scaffold protein). Białka błonowe mogą zostać inkorporowane w takiej dwuwarstwie i badane w roztworach bez detergentów, tak jak białka rozpuszczalne w środowisku wodnym. Powyższa metoda, szeroko używana od kilkunastu lat pozwoliła na badanie białek błonowych metodami wcześniej nieosiągalnymi lub trudnymi do zastosowania. Jednak rozważne jej stosowanie wymaga dogłębnego poznania właściwości nanodysku. W niniejszej pracy badano właściwości lipidowej struktury nanodysku z inkorporowanym białkiem błonowym, bakteriorodopsyną. Tworzenie nanodysków (wariant MSP1E3D1) zostało zoptymalizowane i potwierdzone szeregiem metod- dynamicznym rozpraszaniem światła (DLS), rozdziale w żelu akrylamidowym (SDS-PAGE), transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz filtracji żelowej. Przy pomocy elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) badano wpływ białka błonowego na środowisko wewnętrzne dwuwarstwy lipidowej na jej różnych głębokościach. Wyniki porównano z danymi dla pustych nanodysków i liposomów. Obecność integralnego białka w dwuwarstwie znacznie obniżyła jej polarność, a łańcuchy węglowodorowe ruszały się w sposób anizotropowy. Jednak upakowanie lipidów w dwuwarstwie nie uległo znaczącej zmienie. Powyższe wyniki pozwalają na lepsze zrozumienie modelu błony biologicznej jakim jest nanodysk. Aby jednak odpowiedzieć na pytanie, jak uzyskane przy ich pomocy wyniki są istotne biologiczne, potrzeba większej ilości badań.