Analiza porównawcza oligosacharydów związanych z dolicholem i białkiem w melanocytach i komórkach czerniaka

Changes in the pattern of protein glycosylation during oncogenic transformation result in the emergence of diagnostic and prognostic markers of disease progression. The aim of this study was to determine and compare the N-glycosylation profile of proteins in melanocytes and melanoma cells, as well as to check if differences in glycosylation appear at an early stage of oligosaccharides synthesis on dolichol-phosphate. The study was performed on two human cell lines HEMa-LP (melanocytes) and WM266-4 (metastatic skin melanoma). N-glycans released from dolichol-phosphate (LLO) and proteins (NLO) were analyzed in terms of their structure using high performance liquid chromatography based on hydrophilic interactions (HILIC HPLC) with simultaneous exoglycosidase sequencing digestion of oligosaccharides. In addition, desialylated N-glycans released from protein were analysed by mass spectrometry (MALDI-MS). It was observed that the oligosaccharide fraction released from dolichol consisted mainly of the mature N-glycan precursor (Glc3Man9GlcNAc2) in both melanocytes and metastatic melanoma cells. The results obtained for intermediate structures were inconclusive, and therefore it was impossible to determine the differences in glycosylation between melanocytes and metastatic melanoma cells at the stage of oligosaccharide synthesis on dolichol-phosphate. It was found that N-glycans released from glycoproteins contained in melanocytes were most frequently represented by oligomannose structures, whereas among complex N-glycans the most common were biantennary structures. Metastatic melanoma cells have fewer oligomannose oligosaccharides compared to melanocytes, whereas complex N-glycans were most represented by β1-4-branched triantennary structures. Among the N-glycans released from proteins of the WM266-4 cell line, structures containing β1-3-linked galactose constituted a large proportion. It was found that metastatic melanoma cells have a higher proportion of α2-6 linked sialic acid compared to melanocytes. The comprehensive analysis of N-glycans released from the total pool of glycoproteins present in melanocytes and metastatic melanoma cells discussed in this master's thesis shows changes in protein glycosylation during the transformation into metastatic melanoma. These changes turned out to be mainly quantitative, so further research is needed to improve the methods of assessing the content of individual N- glycans, as well as precisely determining the profile of N-glycans in different stages of melanoma development, in order to determine markers of cancer progression.

Podczas transformacji nowotworowej obserwuje się zmiany we wzorze glikozylacji białek, które mogą stanowić markery diagnostyczne oraz prognostyczne postępu choroby. Celem niniejszej pracy było określenie i porównanie profilu N- glikozylacji białek w melanocytach oraz komórkach czerniaka, a także sprawdzenie czy różnice w glikozylacji pojawiają się już na wczesnym etapie syntezy oligosacharydów na fosfodolicholu. Badanie zostało przeprowadzone na dwóch ludzkich liniach komórkowych HEMa-LP (melanocyty) oraz WM266-4 (metastatyczny czerniak skóry). N-glikany uwolnione z fosfodolicholu (LLO) oraz białka (NLO) zostały przeanalizowane pod względem ich budowy strukturalnej z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej opartej o oddziaływania hydrofilowe (HILIC HPLC) z równoczesnym sekwencyjnym trawieniem oligosacharydów zestawami egzoglikozydaz. Dodatkowo desjalowane N-glikany uwolnione z białka zostały przeanalizowane za pomocą spektrometrii mas (MALDI-MS). Wykazano, że frakcja oligosacharydów uwolnionych z dolicholu składała się głównie z dojrzałego prekursora N-glikanów (Glc3Man9GlcNAc2) zarówno w melanocytach jak i metastatycznych komórkach czerniaka. Wyniki uzyskane dla struktur pośrednich były niejednoznaczne, w związku z czym niemożliwe było określenie różnic w glikozylacji między melanocytami, a metastatycznymi komórkami czerniaka na etapie syntezy oligosacharydów na fosfodolicholu. Stwierdzono, że N-glikany uwolnione z glikoprotein zawartych w melanocytach były najliczniej reprezentowane przez struktury wielomannozowe, natomiast spośród Nglikanów kompleksowych najczęstsze były struktury dwuantenowe. Metastatyczne komórki czerniaka posiadały mniejszą ilość oligosacharydów wielomannozowych w porównaniu do melanocytów, natomiast N-glikany kompleksowe były najliczniej reprezentowane przez struktury trzyantenowe rozgałęzione β1-4. Wśród N-glikanów uwolnionych z białek linii komórkowej WM266-4 duży udział stanowiły struktury zawierające w swoim składzie β1-3 związaną galaktozę. Stwierdzono, że metastatyczne komórki czerniaka posiadają większy udział kwasów sjalowych przyłączonych do N- glikanów wiązaniem α2-6 w porównaniu do melanocytów. Przedstawiona w niniejszej pracy magisterskiej kompleksowa analiza N-glikanów uwolnionych z całkowitej puli glikoprotein obecnych w melanocytach oraz metastatycznych komórkach czerniaka prezentuje zmiany w glikozylacji białek podczas transformacji nowotworowej w przerzutowego czerniaka. Zmiany te okazały się głównie ilościowe, w związku z czym konieczne są dalsze badania w kierunku doskonalenia metod oceny zawartości poszczególnych N-glikanów, a także precyzyjnie określających profil N-glikanów na poszczególnych stadiach rozwoju czerniaka, w celu ustalenia markerów postępu nowotworu.