Differentiation and immunological activity of bone marrow-derived macrophages (BMDM) – the ability to form macrophage extracellular traps (MET)

Extracellular trap (ET) formation is the mechanism of innate immunity used by leukocytes to catch, immobilize and neutralize/kill pathogens. So far, this phenomenon has been mainly studied in neutrophils but other leukocytes including macrophages are also capable of forming ETs. Relatively recently described, macrophage extracellular traps (MET) are one of the novel macrophage weapons against the pathogens. Studies on MET formation are usually performed on macrophage cell lines or macrophages isolated from the organism while fewer focus on bone marrow-derived macrophages (BMDM). Advantages of the latter cells include the intact genotype and the lack of prior contact with antigens. Therefore, the aim of the study was to adopt the technique of obtaining morphologically and functionally differentiated BMDM and to develop a model for induction of MET formation by these cells. The results show that BMDM differentiated from cryopreserved bone marrow cells express the surface marker F4/80+ and are able to express inducible nitric oxide synthase (iNOS) and produce nitric oxide (NO) after stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and zymosan. Furthermore, it was verified that BMDM formed METs upon stimulation with LPS, zymosan and PMA (phorbol myristate acetate) which was verified by staining extracellular DNA of unfixed BMDM. Immunocytochemical analysis of fixed specimens, and their 3D reconstruction, confirmed the co-localization of MET components – histone H2A.X and MMP-9, as well as extracellular DNA constituting the MET backbone. It was also shown that the MET release may dependent on NO and/or its metabolites as the iNOS inhibitor (L-NAME) halted the MET formation by BMDM upon stimulation with LPS and zymosan. In addition, the NO donor (SNAP) induced MET release. In summary, BMDM are capable of forming METs upon stimulation with various immunostimulants, and reactive nitrogen species may be involved in their formation, however, further studies are needed to verify the exact mechanism of MET formation in regard to various immunostimulants, timing or microenvironment.

Tworzenie sieci zewnątrzkomórkowych (ang. extracellular traps, ET) jest mechanizmem odporności wrodzonej wykorzystywanym przez leukocyty do wychwytywania, unieruchamiania i unieszkodliwiania/zabijania patogenów. Jak dotąd zjawisko to było głównie badane w odniesieniu do neutrofili, jednakże także inne leukocyty, w tym makrofagi, są zdolne do tworzenia sieci ET. Stosunkowo niedawno opisane, makrofagowe sieci zewnątrzkomórkowe (ang. macrophage extracellular traps, MET) stanowią jedną z nowo poznanych broni makrofagów w walce z patogenami. Badania dotyczące tworzenia MET są przeprowadzane na liniach komórkowych wywodzących się z makrofagów lub makrofagach wyizolowanych bezpośrednio z organizmu, natomiast nieliczne koncentrują się na wykorzystaniu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (ang. bone marrow-derived macrophages, BMDM). Zaletą tych ostatnich jest m.in. niezmieniony genotyp czy brak wcześniejszego kontaktu z antygenami. Zatem celem niniejszej pracy było zaadoptowanie techniki uzyskiwania zróżnicowanych morfologicznie i funkcjonalnie BMDM oraz opracowanie modelu indukcji tworzenia MET przez te komórki. Z przeprowadzonych badań wynika, że BMDM zróżnicowane z zamrożonych komórek szpiku kostnego wykazują ekspresję markera powierzchniowego F4/80+, a także są zdolne do ekspresji indukowalnej syntazy tlenku azotu (ang. inducible nitric oxide synthase, iNOS) oraz produkcji tlenku azotu (ang. nitric oxide, NO) po stymulacji lipopolisacharydem (ang. lipopolysaccharide, LPS) i zymosanem. Ponadto zweryfikowano, że pod wpływem LPS, zymosanu i PMA (ang. phorbol myristate acetate), BMDM tworzą sieci MET, co sprawdzono poprzez wybarwienie zewnątrzkomórkowego DNA nieutrwalonych BMDM. Immunocytochemiczna analiza preparatów oraz ich rekonstrukcja 3D potwierdziły kolokalizację komponentów MET – histonu H2A.X oraz MMP-9, a także zewnątrzkomórkowego DNA stanowiącego szkielet MET. Wykazano także, że proces wyrzutu MET może być zależny od NO i/lub jego metabolitów, gdyż inhibitor iNOS (L-NAME) hamował tworzenie MET przez BMDM pod wpływem LPS i zymosanu, a ponadto donor NO (SNAP) indukował wyrzut MET. Podsumowując, BMDM są zdolne do tworzenia sieci MET pod wpływem różnych immunostymulantów, a w mechanizm ich tworzenia mogą być zaangażowane reaktywne formy azotu, jednak potrzebne są dalsze badania pozwalające na weryfikację dokładnego mechanizmu tworzenia MET w zależności od różnych immunostymulantów, czasu stymulacji, czy mikrośrodowiska.