Immunochemical detection of selected markers of civilization diseases

Immunochemia to nauka biomedyczna zajmująca się głównie strukturą chemiczną antygenów i przeciwciał. Przeciwciała wykorzystywane w barwieniach immunochemicznych najczęściej oznaczane są cząsteczkami wykazującymi zdolność do emisji energii w postaci fluorescencji po pobudzeniu promieniowaniem elektromagnetycznym o odpowiedniej długości. Umożliwia to barwienie komórek lub tkanek w celu określenia biodystrybucji wybranych substancji chemicznych, w tym markerów chorób cywilizacyjnych, np. miażdżycy. Celem niniejszej pracy było opracowanie metodologii multipleksowego barwienia immunochemicznego dla markerów chorobotwórczych miażdżycy na przykładzie układów ze zmieniającą się dystrybucją takich cząstek jak alfa aktyna mięśni gładkich (ang. alpha-Smooth Muscle Actin, ⍺-SMA) i płytkowo-śródbłonkowa molekuła adhezyjna-1 (ang. platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1), zarówno w tkance zdrowej jak i w przypadku postępującego procesu miażdżycowego. W pierwszej części badań ustalono optymalne warunki dla barwienia pojedynczego, a następnie zoptymalizowano je pod kątem barwienia multipleksowego. Kluczowy dla wyników barwienia okazał się czas inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Ważnym etapem było także usunięcie niezwiązanego z antygenem przeciwciała oraz pozostałych odczynników. Dobór drugorzędowego przeciwciała, ze względu na możliwość niespecyficznego wiązania z antygenem również wpływał na jakość uzyskanych obrazów fluorescencyjnych. Uzyskany protokół barwienia immunofluorescencyjnego poprawnie wyznaczył dystrybucję białek α-SMA i PECAM-1 w aorcie na skutek rozwoju miażdżycy.

Immunochemistry is a biomedical science that deals mainly with the chemical structure of antigens and antibodies. Antibodies used in immunochemical staining are most often labeled with molecules showing the ability to emit energy in the form of fluorescence after stimulation with electromagnetic radiation of the appropriate length. This allows staining of cells or tissues to determine the biodistribution of selected chemical substances, including markers of civilization diseases, e.g. atherosclerosis. The purpose of this work was to develop a methodology for multiplex immunochemical staining for disease markers of atherosclerosis on the example of systems with changing distribution of particles such as alpha-Smooth Muscle Actin (⍺-SMA) and platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1), both in healthy tissue and in the case of a progressive atherosclerotic process. In the first part of the study optimal conditions for single staining were determined and then optimized for multiplex staining. Incubation time with the primary antibody turned out to be crucial for the staining results. An important step was also the removal of non-antigen-bound antibody and other reagents. The selection of the sec-ondary antibody, due to the possibility of non-specific binding to the antigen, also influenced the quality of the obtained fluorescent images. The obtained immunofluorescent staining protocol correctly determined the distribution of α-SMA and PECAM-1 proteins in the aorta due to the development of atherosclerosis.