Analysis of the Zc3h12a gene expression in primary cholangiocytes isolated from Mcpip1AlbKO mice

Wątroba jest największym gruczołem organizmu ludzkiego. Zbudowana jest w ok. 80% z hepatocytów, które stanowią jej miąższ. W obrębie wątroby wyróżnia się również komórki takie jak: cholangiocyty, sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby, komórki Kuppfera oraz komórki gwiaździste wątroby. Cholangiocyty to komórki nabłonkowe wyścielające drogi żółciowe. System rekombinacji Cre-loxP jest jednym z molekularnych narzędzi stosowanym do wprowadzania zmian w obrębie DNA. Składa się on z jednego enzymu – rekombinazy Cre, który przeprowadza reakcję rekombinacji pomiędzy sekwencjami loxP. Dzięki systemowi Cre loxP możliwe jest wprowadzenie zmian genetycznych w obrębie jednej tkanki, przy zastosowaniu tkankowo-specyficznych promotorów rekombinazy Cre. Promotor albuminy jest specyficzny dla wątroby, a jego ekspresja zachodzi m.in. w hepatocytach i cholangiocytach. Białko MCPIP1 należy do rodziny 4 białek MCPIP, które kodowane są przez geny ZC3H12A D u ludzi oraz Zc3h12a-d u myszy. Jego najważniejszą funkcją jest negatywna regulacja stanu zapalnego poprzez degradację mRNA, miRNA oraz hamowanie NF-κB. W prezentowanej pracy zbadano ekspresję genu Zc3h12a kodującego białko Mcpip1 w cholangiocytach myszy Mcpip1AlbKO (myszy wykazujące ekspresję rekombinazy Cre pod promotorem genu albuminy oraz posiadające sekwencje LoxP w genie Zc3h12a). Kontrolami były myszy Mcpip1fl/fl, posiadające sekwencje LoxP w genie Zc3h12a. Z myszy poddanych eksperymentom wycinano wątroby, izolowano pod mikroskopem przewody żółciowe, a następnie prowadzono hodowlę pierwotnych cholangiocytów, które z nich wyrosły. Po przeprowadzeniu kilku pasaży izolowano z komórek RNA, przeprowadzono odwrotną transkrypcję, a następnie reakcję PCR w czasie rzeczywistym. W cholangiocytach izolowanych z myszy Mcpip1fl/fl ekspresja genu Zc3h12a była wyższa niż w komórkach z myszy Mcpip1AlbKO. Analiza krzywych topnienia wygenerowanych podczas reakcji PCR wykazała, że w większości badanych komórek wyizolowanych z myszy Mcpip1AlbKO nie doszło do powstania specyficznego produktu. W prezentowanej pracy wykazano, że w cholangiocytach myszy Mcpip1AlbKO nastąpiło wyciszenie ekspresji genu Zc3h12a kodującego białko Mcpip1.

The liver is the largest gland of the human body. Hepatocytes account for about 80% of liver volume and are the major parenchymal cell type of the liver. Within the liver, cells such as cholangiocytes, sinusoidal endothelial cells, Kuppfer cells and hepatic stellate cells are also distinguished. Cholangiocytes are epithelial cells lining the bile ducts. The Cre-loxP recombination system is one of the molecular tools used to carry out changes at specific sites in the DNA. The system consists of single enzyme – Cre recombinase, that catalyse the recombination between loxP sites. Using tissue specific promoters of Cre allows to introduce genetic changes, within one specific tissue. One of the liver-specific promoters is albumin, expressed for instance in cholangiocytes. The MCPIP1 protein belongs to the family of 4 MCPIP proteins, encoded by ZC3H12A-D genes in human and Zc3h12a-d in mice. Its most important function is negative regulation of inflammation through degradation of mRNA, miRNA and inhibition of NF-κB. Following study examined the expression of Zc3h12a gene encoding Mcpip1 protein in the cholangiocytes of Mcpip1AlbKO mice (mice expressing Cre recombinase under the albumin gene promoter, with LoxP sequences in the Zc3h12a gene). Mcpip1fl/fl mice with LoxP sequences in the Zc3h12a gene were controls in the study. From the experimental mice livers were excised, the bile ducts were isolated under a microscope, and then the primary cholangiocytes that grew from them were cultured. After several passages RNA from cells was isolated, then reverse transcription and quantitative real-time PCR were conducted. In cholangiocytes isolated from Mcpip1fl/fl mice the Zc3h12a gene expression was higher than in cells from Mcpip1AlbKO mice. Analysis of the melting curves generated during the PCR reaction showed that in the majority of tested cells from Mcpip1AlbKO mice no specific product was produced. In the following study it was shown that in cholangiocytes from Mcpip1AlbKO mice the expression of Zc3h12a gene encoding the Mcpip1 protein was silenced.