Analysis of 3-methyl-tetraacetyl riboflavin and riboflavin in human skin cancer cells A431

Riboflavin (Rfl) is one of the water-soluble vitamins belonged to group B, which due to its photoactivity has been used in an innovative therapeutic method, called photodynamic therapy (PDT). Exposure of vitamin B2 to UV/VIS radiation (10-770nm) leads to its gradual breakdown, which weakens its effectiveness as a potential sensitizer. Hence, an acetylated riboflavin derivative; 3-methyl-tetraacetyl riboflavin (3MeTARF), which is a photostable compound non-degrading under the influence of radiation light, and exhibits similar spectral properties to riboflavin, seems to be a better compound for using in PDT.The purpose of this Master's thesis was to analyze the mechanisms of 3MeTARF and riboflavin phototoxicity in human skin cancer cells, A431. The carried out experiments included analysis of cell viability (using the MTT test) and apoptosis (by annexin V/7AAD staining and caspase 3/7 activity measuring), measurement of oxidative stress (by DHR123 assay) and by using Western Blot we analyzed level of MAP kinases (p38 and JNK) and p53 under conditions of photogenerated stress. Additionally, we analyzed the effect of specific MAPK inhibitors on 3MeTARF or riboflavin induced caspase 3/7 activation. The obtained results indicate that both chemical compounds induced oxidative stress, with was confirmed by addition of compounds with antioxidant activity: ascorbate and α-tocopherol. Photo-oxidative stress, 1 hour after irradiation, increase the level of p53 protein and phosphorylated forms of MAP kinases (p38 and JNK), with are necessary for the activation of the caspase cascade and lead to apoptotic cell death. 3MeTARF proved to be a more effective photosensitizer than riboflavin in all the studied processes.Obtained results are the basis for further research into useage of phototoxic properties of 3MeTARF against cancer cells, e.g. in animals in PDT therapy.

Ryboflawina (Rfl) to jedna z witamin rozpuszczalnych w wodzie zaliczana do witamin z grupy B, która ze względu wykazywaną fotoaktywność znalazła zastosowanie w innowacyjnej metodzie terapeutycznej, jaką jest terapia fotodynamiczna (PDT). Ekspozycja witaminy B2 na promieniowanie z zakresu UV/VIS (10-770nm) powoduje jej stopniowy rozpad, co osłabia jej efektywność jako potencjalnego sensybilizatora. Stąd, acetylowana pochodna ryboflawiny; 3-metylo-tetraacetylo ryboflawina (3MeTARF), która jest związkiem fotostabilnym i nie ulega degradacji pod wpływem promieniowania, a wykazuje podobne do ryboflawiny właściwości spektralne, wydaje się być lepszym związkiem do zastosowania w PDT. Celem niniejszej pracy magisterskiej była analiza mechanizmów fototoksyczności 3MeTARF oraz ryboflawiny w komórkach raka skóry A431, która obejmowała ocenę żywotności komórek (za pomocą testu MTT) i apoptozy (poprzez barwienie aneksyną V/7AAD oraz pomiar aktywności kaspaz 3/7), pomiar stresu oksydacyjnego (test z DHR123) i analizę Western Blot ufosforylowanych form białkowych kinaz MAP (p38 i JNK) oraz białka p53 w warunkach fotogenerowanego stresu komórkowego. Dodatkowo zbadano wpływ specyficznych inhibitorów MAPK na aktywność kaspaz 3/7 indukowanych światłem niebieskim w obecności 3MeTARF lub ryboflawiny. Wyniki przeprowadzonych pomiarów wskazują, iż obydwa związki chemiczne indukują stres oksydacyjny, co potwierdzono przez wprowadzenie do układu związków o działaniu przeciwutleniającym: askorbinianu oraz α-tokoferolu. Indukowany stres fotooksydacyjny już po 1 godzinie od zakończenie naświetlania zwiększa poziom białka p53 oraz ufosforylowanych form białkowych kinaz MAP (p38 i JNK), niezbędnych do aktywacji kaskady kaspaz, prowadzącej do apoptotycznej śmierci komórek. We wszystkich badanych procesach 3MeTARF okazał się być skuteczniejszym fotosensybilizatorem niż ryboflawina.Uzyskane wyniki są podstawą do kolejnych etapów badań nad wykorzystaniem fototoksycznego działania 3MeTARF względem komórek nowotworowych, np. na zwierzętach w terapii PDT.