The influence of Dabrafenib and Vemurafenib on RIPK4 protein levels in cells carrying V600 type mutation

BRAF protein is one of the component of MAPK kinase pathway, which regulates key processes such as cell cycle control. It plays an important role in proliferation, differentiation and migration of the cell. Mutation in the gene encoding BRAF, located in codon 600 leads to increased proliferation rate, enhanced survival and the ability to avoid apoptosis, causing acquisition of malignant features. V600BRAF mutation is common in many human cancers, including colorectal adenocarcinoma or melanoma, however it is becoming a negative prognostic factor. Currently available treatment for patients diagnosed with this mutation are small-molecular weight inhibitors: dabrafenib or vemurafenib. It is believed that the receptor interacting protein 4 (RIPK4) can also play an oncogenic function. Moreover, the structural similarity between BRAF and RIPK4 proteins is very high. Therefore, the aim of the thesis was to investigate the RIPK4 protein levels in malignant cells carrying the V600 type. We chose human melanoma cell lines: WM 266.4, A375 and colorectal adenocarcinoma cell line LoVo. Then, using Sanger sequencing method we analyzed the genome sequence to determine the presence of BRAF mutation in codon 600. We confirmed the presence of the mutation in WM 266.4 cells, therefore, we selected this cell line for further studies. Both vemurafenib (0-10uM) and dabrafenib (1-10 nM) inhibit level of phosphorylated ERK ½ in a dose-depended manner after 3 hours of incubation whereas RIPK4 level decreased after 6 hours. Those results correlate with decrease of survival of the cells measured with MTT test and reorganization of actin cytoskeleton and size of local contacts after 24 hour of treatment with drugs by indirect immunofluorescence technique. Deeper understanding of molecular pathways is a necessary step forward to discover more effective targeted therapies to patients being at their third or fourth stage of colorectal adenocarcinoma or melanoma malignant cancer.

Białko BRAF jest jednym z komponentów szlaku kaskady MAPK (ang. mitogen activated protein kinase). Kaskada ta jest jednym z głównych regulatorów cyklu komórkowego. Odpowiedzialna jest za kontrolę kluczowych procesów zachodzących w komórce, takich jak proliferacja, różnicowanie, czy migracja. Mutacja w genie BRAF w pozycji 600 genu prowadzi do ciągłej aktywacji tego szlaku, czego efektem jest niekontrolowana proliferacja, przeżycie oraz zdolność komórek do unikania apoptozy, a w efekcie do nabycia cech złośliwych komórek. Mutacja typu V600BRAF jest powszechna w wielu typach nowotworów, m.in. raku jelita grubego czy czerniaku, a jej obecność staje się negatywnym czynnikiem rokowniczym. W chemioterapii pacjentów ze stwierdzoną mutacją V600BRAF wykorzystuje się niskocząsteczkowe inhibitory zmutowanej formy białka BRAF: dabrafenib bądź wemurafenib. Funkcję onkogenną przypisuje się również białku RIPK4 (ang. receptor interacting protein), której podobieństwo strukturalne do białka BRAF jest bardzo wysokie. Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu obu inhibitorów białka BRAF na poziom kinazy RIPK4 w komórkach zawierających mutację typu V600. Do badań wybrano dwie linie komórkowe czerniaka złośliwego (WM 266.4 oraz A375) oraz jelita grubego (LoVo). Następnie sprawdzono ich sekwencje nukleotydowe pod kątem obecności mutacji typu V600. Sekwencjonowanie metodą Sangera potwierdziło obecność mutacji jedynie w linii komórkowej WM 266.4, dlatego komórki tej linii wybrano do dalszych badań. Stosując metodę Western Blot, wykazano, że zarówno wemurafenib (0-10uM) jak i dabrafenib (1-10 nM) po 3 godzinach obniża poziom ufosforylowanego białka ERK 1/2, a po 6 godzinach poziom białka RIPK4 w sposób zależny od dawki. Wyniki te korelują z obniżeniem przeżywalności komórek mierzoną za pomocą testu MTT, a także zmianą morfologii cytoszkieletu aktynowego oraz rozmiarem kontaktów zogniskowanych analizowanych za pomocą immunofluorescencji pośredniej po 24 godzinach inkubacji lekami.Głębsza analiza szlaków molekularnych jest krokiem niezbędnym do opracowania skuteczniejszych terapii celowanych, mających na celu poprawę przeżycia pacjentów będącym w III lub IV stadiach nowotworu jelita grubego czy czerniaka.